小鼠卵巢体外培养过程中FSH干预对VEGF及其受体表达的影响

张旭红，陈 杰

(1.乌兰察布市中心医院产科，内蒙古 乌兰察布 012000；2.内蒙古医科大学人体解剖学教研室，内蒙古 呼和浩特 010000)

近年来，不孕不育患者比例呈逐年增高趋势[1]。随着国家生育政策的开放，较多家庭选择生育二胎，有生育需求的高龄产妇比例大幅增加。为此，辅助生殖技术飞速发展，也推动了卵巢组织体外保存技术的发展，但是卵巢组织在体外保存过程中，大量卵泡丢失、死亡，或者出现空卵泡等卵巢早衰现象，为卵巢组织体外保存技术带来了新的挑战。促卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)能够促进卵泡的发育成熟[2]，抑制颗粒细胞的凋亡，同时促进卵泡周围颗粒细胞VEGF及缝隙连接蛋白的表达，从而促进血管生成、卵泡发育成熟[3]。研究显示，适当剂量的FSH体外短暂干预新鲜卵巢组织可有效提高冻融卵巢卵泡的存活率，并缩短冻融卵巢组织移植后血流重建时间，其机制是上调了能加速血管新生以及血管重建的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达[4]。血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2)是VEGF调控血管新生的主要酪氨酸激酶功能受体[5]，主要功能是在各种病理、生理情况下介导新生血管的形成[6]，同时其也是血管新生和有丝分裂过程主要的VEGF信号转导受体。因此，本研究拟通过小鼠卵巢组织体外培养过程中添加FSH的干预方式探究其在卵巢组织体外培养过程中是否可有效保护卵巢组织，以期为提高辅助生殖技术成功率、促进卵巢组织体外培养技术发展提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 以9只4周龄(处于青春期)C57BL/6J(合格证号:000664)雌性小鼠为研究对象，每日光照12 h，环境温度保持在22～24 ℃，自由饮水取食。

1.1.2 主要试剂 FSH：注射用重组人卵泡刺激素(果纳芬)购自瑞士默克雪兰诺制药厂；白蛋白：人血清白蛋白购自Sigma；一抗VEGF及VEGFR-2(兔抗小鼠多克隆抗体)购自Abcam；荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液体的配制 基液按DMEM∶F12(1∶1)配制。培养液含12%人血清白蛋白，添加FSH浓度为0.3 IU/mL。

1.2.2 卵巢组织的获取 颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精消毒，在背部肾区切开皮肤及筋膜取出卵巢组织。

1.2.3 实验分组 将9只小鼠卵巢组织剥去外膜，随机分为3组，每组6枚。新鲜对照组(CG组)：提取卵巢组织后直接固定或提取总RNA。体外培养对照组(VCG组)：提取卵巢组织后将其放入培养液于37 ℃ CO2培养箱中培养60 min，之后投入液氮冻存24 h，解冻过程为冻存组织依次浸入梯度递减的解冻液，组织解冻完成再进行固定或提取总RNA，冻存全程不添加FSH干预。FSH干预体外培养组(IG-FSH组)：体外培养过程添加0.3 IU/mL FSH，进行保护性干预。

1.2.4 免疫组织化学实验观察VEGF、VEGFR-2表达 将卵巢组织以4%多聚甲醛固定24 h，用多聚赖氨酸处理后的载玻片制作石蜡切片(切片厚度5 μm)。将切片脱水，PBS液冲洗3次，每次5 min，柠檬酸盐缓冲液微波加热法进行抗原修复。后续3% H2O237 ℃避光孵育10 min，山羊血清(与二抗同源)37 ℃封闭30 min。加一抗(VEGF稀释为1∶200，VEGFR-2稀释为1∶100)4 ℃过夜。第2天，切片复温30 min，PBS液冲洗3次，每次5 min，反应增强液37 ℃孵育30 min，二抗37 ℃孵育60 min，DAB(1∶50)显色，镜下观察，PBS终止反应，封片。显微镜下观察VEGF及VEGFR-2阳性表达情况。采用DP Ctroller 3.1.1.267及Image Pro Plus 6.0软件拍照并按阳性表达的热区检测累积光密度值(IOD值)。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测VEGF、VEGFR-2 mRNA表达 引物由上海生物工程有限公司合成，VEGF上游引物：5′-GTAACGATGAAGCCCTGGAGT-3′，下游引物：5′-TGTTCTGTCTTTCTTTGGTCTGC-3′；VEGFR-2上游引物：5′-ACTGTCATCCTTACCAATCCCA-3′，下游引物：5′-ATCTGGGGTGGGACATACAC-3′。采用TRIZOL法提取小鼠总RNA：将玻璃化冻融后的小鼠卵巢组织迅速放入预冷的匀浆器中研磨，再转入无RNA酶的1.5 mL EP管中静置5 min；加入200 μL氯仿震荡15 s后于室温静置2 min，于4 ℃以12 000 r/min转速离心15 min；取上层水相，移至另1根1.5 mL EP管中；加入500 mL异丙醇，颠倒混匀，再于4 ℃以12 000 r/min转速离心10 min；晾干，加入1 mL冰预冷的75%乙醇充分混匀洗涤，再于4 ℃以7 500 r/min转速离心5 min；晾干，溶于高压后的DEPC水，-80 ℃保存。检测A260:A280的比值，确定RNA的纯度。逆转录cDNA单链合成：加入2 μL TotalRNA、1 μL Anchored Oligo(dT) 18 Primer、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransScript RT/RI Enzyme Mix、1 μL gDNA Remover、5 μL RNase-free Water、20 μL Total轻轻混匀，于4 ℃以12 000 r/min转速离心1 min；将样品置于PCR扩增仪内进行反转录，反应条件为：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃再循环。经PCR设定温度梯度，确定退火温度。反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，循环30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃降温10 min。上机进行实时荧光定量PCR检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 15.0统计软件，免疫组织化学技术及实时荧光定量PCR检测结果均采用单因素方差分析检验，按α=0.05为检验水准，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FSH干预对VEGF及VEGFR-2蛋白表达的影响

免疫组织化学结果显示，IG-FSH组中VEGF及VEGFR-2蛋白表达量均高于CG组和VCG组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 实时荧光定量PCR检测FSH干预后VEGF及VEGFR-2 mRNA表达

实时荧光定量PCR结果显示：IG-FSH组和CG组VEGF mRNA表达量显著高于VCG组(P<0.05)，但IG-FSH组和CG组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2a。IG-FSH组VEGFR-2 mRNA表达量显著高于CG组及VCG组(P<0.05)，CG组与VCG组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2b。

a：VEGF免疫组织化学结果及定量分析；b：VEGFR-2免疫组织化学结果及定量分析 ★：原始卵泡；■：初级卵泡；▲：次级卵泡；*：与CG组比较，P<0.05；#：与VCG组比较，P<0.05图1 FSH干预对体外保存卵巢组织VEGF及VEGFR-2蛋白表达的影响

a：VEGF;b:VEGFR-2 *：与VCG组比较，P<0.05；#：与CG组比较,P<0.05图2 实时荧光定量PCR检测mRNA表达结果

3 讨论

VEGF作为高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有增加血管通透性，促进血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等重要作用[7]。而小鼠卵巢组织体外培养过程中血管的通透性以及内皮细胞的迁移直接关系到体外保存过程中卵泡的存活数量及质量[8]。VEGF在发挥促进内皮细胞增殖作用时，主要由内皮细胞表面的VEGFR-2(即VEGF受体)介导，VEGF与VEGFR-2结合后引起自身及相关蛋白的磷酸化[9-10]，从而启动细胞间信号转导以及信息传递，进而促进内皮细胞的分裂增殖，对维持卵巢组织体外培养过程中卵泡的正常生长发育有积极作用[11]。FSH作为辅助生殖技术中应用广泛的药物之一，可对生殖细胞的发育成熟以及卵巢组织的内分泌功能发挥积极作用[12]。

本研究免疫组化实验表明，在卵巢组织体外培养过程中添加FSH进行保护性干预可有效促进VEGF及VEGFR-2蛋白的表达，效果显著优于CG组和VCG组。FSH在卵泡存活过程中发挥着重要作用,而VEGF及其受体VEGFR-2在FSH的促进作用下有效结合，直接影响了卵巢间质细胞的血管重建与再生，为体外培养过程中卵泡的存活提供了先决条件[13]。本研究实时荧光定量PCR检测结果也证实，卵巢组织在体外培养过程中经添加FSH干预性保护作用后，增加了VEGF及VEGFR-2 mRNA的表达，证明VEGF及VEGFR-2具有激素依赖性[14]，且在FSH的刺激作用下更有利于VEGF与其受体VEGFR-2结合充分发挥作用。据报道，FSH的干预是促进VEGF及VEGFR-2表达的重要因素，且VEGF及其受体VEGFR-2能够使卵泡数量成倍增加，本实验证实了FSH在卵巢组织体外培养过程中起到了增加VEGF、VEGFR-2表达及促进两者结合的双重作用，在卵巢组织玻璃化冻存过程中有效保护了卵巢卵泡的功能，为后期体外受精打下坚实基础[15-16]。

综上所述，小鼠卵巢组织体外培养过程中添加FSH进行干预性保护，可有效促进VEGF及VEGFR-2的表达，保证体外培养过程中的卵泡数量，减少卵泡损失，为辅助生殖技术的发展提供了实验室研究证据。