胃癌干细胞标志物的研究进展

代俊泽 金海峰 (延边大学 医学院，吉林 延吉 3300；附属医院内科教研室)

胃癌(GC)在全部恶性肿瘤中的致死率常年居高不下(排名前3)。早期GC的发生发展通常没有明显病症，这就造成了许多患者发现时已经处于晚期，无法进行治疗或治疗无效。有调查显示，在2018年GC新病例超过1 000 000例，并估计有783 000例患者死亡〔1〕。随着近代医学的日益更新，对肿瘤本质的掌握也更加透彻，于是出现了癌症干细胞(CSC)理论。近年愈来愈多的实验也表明，胃干细胞的定位与GC发生地点相互吻合，意味着可以从干细胞疾病的治疗方向入手来治疗GC。目前，GC的治疗仍以传统的放射线疗法和化学疗法为主，但此方案的短板是不能完全消除CSC。因此，探索稳定性高、特异性强并检测难度小的GC干细胞(GCSC)标志物，或许能为消灭癌症、根治GC提供一种全新的方案。此文针对现阶段研究较多或较成熟的GCSC标志物作一综述，提出较新颖、潜力大的治疗方案。

1 CSC

大多数肿瘤是由一个细胞亚群结合而来，这个亚群最大的特点就是具有干细胞特性，称为CSC。CSC对整个肿瘤的生命起关键作用，采用自我无限增殖方式来影响肿瘤的启动、发展及治疗后复发概率。CSC的起源包括以下几种：①恶性肿瘤的实质细胞；②协助或诱发肿瘤扩散的细胞；③因耐药性而诱发或复发的因素〔2〕。相关研究数据〔3，4〕也表明，CSC可诱导肿瘤的发生，并在随后的转移、治疗(放疗或化疗)中起决定性作用。综上可见，CSC是肿瘤增殖引发剂之一，现阶段普遍认同通过此靶点治疗效果优于传统治疗方案。

2 GCSC标志物

现阶段GCSC标志物主要包括造血干细胞抗原(CD133)等(表1)。其中主要参与癌症发生、发展的有CD133、富含亮氨酸重复序列的G蛋白耦联受体(Lgr)5、上皮细胞黏附因子(EpCAM)等；CD44、miRNA、性别决定区Y框蛋白(SOX)2对胃癌的转移及侵袭影响较大；作用于癌症预后主要有CD44、三磷酸腺苷酶结合盒转运蛋白G亚家族成员(ABCG)2等；CD24、乙醛脱氢酶(ALDH)1等可增强癌症组织对药物的耐药性。以上通常可用于鉴别和分离GCSC。

表1 GCSC相关生物学标记物

2.1CD133 CD133约120 kD，是一种单拷贝基因产物，主要局限于肿瘤组织表达，在癌后病变的阶段沿黏膜内癌和结缔组织之间的边界表达〔5〕。它被普遍发现于多种恶性肿瘤的，鉴于此并在相关实验中加以使用〔6～8〕。以GC为例，陆瑞祺等〔9〕的研究发现，在原发性GC的黏膜和黏膜下层细胞膜上均可见CD133的表达，并且表达程度相较于癌旁正常胃组织显著上移(P<0.05)。并且CD133+子集细胞可以在人类GC中分离、纯化和扩增。此外，也具有如提高体内的致瘤能力等。因此，可以表达一些干细胞标记。

此外，CD133还是良好的预后标志〔10〕。Chen等〔11〕实验显示，高水平的CD133患者的预后较低水平患者明显降低(P<0.001)，由此说明，CD133可成为独立预后因素，Liu等〔12〕实验表明，CD133+可以预测GC患者的存在或即将出现的临床病理特征和较差的生存率。此外，CD133也可能在GC的病理生理，整合和补充中起关键作用。

5-氟尿嘧啶(Fu)化疗是GC晚期的一种首选治疗方案，但其有效性受到耐药性的限制。同时也存在实验〔13，14〕表明，CD133可以通过调节GC细胞中磷酸肌醇3-激酶/Akt/p70S6K途径介导的P-gp和Bcl-2家族的表达来抑制5-Fu诱导的凋亡。Xu等〔15〕实验发现，经5-Fu的化疗后，剩余的GC组织中B淋巴瘤Mo-MLV插入区(BMI)1(参与CSC维持的关键分子)的表达增加了。并且，基于5-Fu的新辅助治疗后接受手术的GC患者BMI1表达与无病生存之间存在直接关系。由此，提示BMI1也是一种潜在的应用价值较大的靶向治疗方向。

以上研究均证明CD133可作为GC鉴别、诊断及预后的重要生物指标，并对GC患者开发新的治疗方案起到一定的作用，但涉及的具体调节机制仍需进一步探究。

2.2CD44 CD44基因高度保守，相对分子质量为85～200 kD，位于第11号染色体上。CD44家族包括普遍表达的标准CD44(CD44s)和在角质形成细胞(CD44v3-v10)，上皮细胞(CD44v8-v10)及活化的淋巴细胞和巨噬细胞(CD44v6)中具有特定分布的CD44剪接变体(CD44v)。

Mayer等〔16〕最先发现，CD44的表达在GC患者中预示着癌症发展恶劣。这一点在后来相关研究〔17，18〕中也得到了证实。此外，大量实验〔19～21〕进一步观察到CD44及CD44v6具有正向调节淋巴结转移和远处转移的意义，且与GC患者预后较差有关。这显示CD44和CD44v6可能均是GC患者有效的鉴别或预后的生物标志物。AT-hook2(HMGA2)是一种高迁移率的转录调节剂，可在CSC中介导运动性和自我更新。Sun等〔22〕实验发现，HMGA2可通过调节CD44的表达来促进GCSC诱导和细胞运动。因此，在GC中靶向HMGA2可对治疗提供了新的方向。

目前，随着生物材料工程学的进步，允许在水凝胶中设计模仿重要肿瘤样特征的三维(3D)培养物，从而揭开传统2D塑料表面无法观察到的癌细胞行为。在3D培养物中，GC细胞失去了标准CD44同种型(CD44s)的表达，而获得了CD44变体6(CD44v6)的表达。并且这种剪接开关是可逆的，由于营养缺乏而加速，并在较低的初始细胞密度下延迟，提示环境胁迫诱导的应答。进一步显示它依赖于水凝胶基质的机械性能，并伴随着上皮-间质转化(EMT)，代谢和血管生成的基因上调〔23〕。这项研究提供了一种新的模型系统来研究CD44功能障碍，其在癌症中的作用已受到关注数十年。

2.3CD24 CD24又命名为热稳定抗原(HSA)，为一种细胞黏附分子存在或表达于许多B淋巴细胞和分化神经母细胞表面。CD24在不同种肿瘤中的表达也不尽相同，如宫颈癌中表达程度显著大于乳腺癌。

Wang等〔24〕和Zhao等〔25〕实验发现，CD24可促进细胞侵袭并调节GC细胞中E-钙黏蛋白，纤连蛋白和维生素D受体的表达进而促进GC发生并促进侵袭来诱导GC发展。同时，Jiao等〔26〕研究也发现，CD24参与人GC细胞系AGS的增殖，侵袭和化学敏感性，而CD24蛋白表达的下调降低了GC细胞的转移潜能并增加了化学敏感性。Xu等〔15〕的研究证明，5-FU耐药的人GCSC样细胞的 CD133和CD44高表达及CD24低表达参与GC的发生发展及治疗后复发。以上研究均证明CD24 高表达可作为GC细胞中的CSC标志，同时表达水平的高低也可被认为是独立的预后因素。此外，在Jia等〔27〕实验发现，CD24基因中的P-534位点影响了GC总体生存，提示可从此位点入手，为临床胃癌的诊断、预后等提供了新思路。

2.4Lgr5 Lgr5是Wnt通路的靶基因。可用于标记胃上皮祖细胞。Lgr5在胃CSCs的维持中具有至关重要的作用〔28，29〕，有可能是GC潜在治疗靶点。Simon等〔30〕和Liu等〔31〕实验发现，Lgr5高表达与总生存率低显著相关，且Lgr5+GC患者的中位生存期(28.0±8.6)个月比Lgr5-患者(54.5±6.3)个月短，提示高Lgr5与GC患者预后不良有关。大量研究〔32～34〕表明，形成肿瘤球的标本中GC细胞表达高Lgr5。Lgr5阳性GC细胞的选择性耗竭导致GC细胞的生长明显被抑制，提示Lgr5非常有希望成为GC潜在干细胞标志物。此外，相关研究〔35～37〕发现，高表达的Lgr5与肿瘤的TNM阶段、大小、浸润深度等并无联系，与患者年龄与GC类型存在很大的关系。Lgr5可能参与了GC发生过程中的肠上程度皮化生。这种病理分型的差异，对制定GC恰当治疗方案具有现实意义。

同时，Lgr5的表达具有空间性和时间性〔30〕。在非肿瘤性胃黏膜中，LGR5+细胞主要定位在黏液颈部。在肠上皮化生中，LGR5+细胞主要定位隐窝底部，但在GC中，LGR5阳性细胞定位于肿瘤中央区域和管腔表面部位。LGR5在GC的肿瘤中心表达与肿瘤的局部生长(T类)和淋巴结扩散(N类)显著相关，这也为GC的靶向治疗方法提供了新思考方向。

2.5EpCAM EpCAM由GA-733-2基因编码，其胞内区域有26个氨基酸残基，胞外区域有265个氨基酸残基组成的两个生长因子样结构，分子量为40 kD。

Warneke等〔38〕实验发现，EpCAM信号通路中的所有成员均在GC中表达。并且，该表达彼此之间以及与各种临床病理患者特征(包括患者的存活)显著相关。由此说明，EpCAM信号通路是GC中比较理想的治疗靶标。其他相关实验〔39～42〕也表明，GC组织中的EpCAM表达上调，并与GC的大小及扩散呈现一定联系，可能预示预后较差。这意味着EpCAM可能作为一种新的预后因素。Chen等〔43〕调查进一步证实，EpCAM与肿瘤的进一步恶化发展相关，低表达更有利于患者的预后。因此，它可作为独立的预后因素。以上均说明 EpCAM可作为 CSC 标志物在预后方面的价值，对GC具有重要意义。

2.6ABCG2 ABCG2被称为与人类肿瘤中多药耐药性相关的关键调节剂，能够拮抗部分化疗药物的抗肿瘤作用〔44，45〕。它属于ABC转运蛋白家族的一位成员。

在Wang等〔46〕调查中，通过对NCBI GEO数据库中19 826个样本进行分析，观察到ABCG2经常在GCCG中异常表达，并与GC的临床病理特征和不良的预后有关。同时还发现关键的GC启动子CRKL与ABCG2呈显著正相关，很可能是上游CRKL的靶标，提示可以从此方向进一步研究其用于GC诊断和治疗。研究表明〔47〕，ABCG2 表达异常增高，这也就意味着肿瘤患者术后复发概率很大，并且在治疗后整个也会遇到许多问题。

SP细胞是肿瘤起始细胞的一个细胞亚群。ABCG2赋予了SP细胞的大部分形态，即CSC。通过Nishii等〔48〕实验，GCSP细胞接种产生的Oct3和Sox2的表达增加，提示ABCG2联合SP细胞检测可进一步纯化GCSC。

2.7CHI3L1 壳多糖酶3样蛋白1长度约40 kD，是一种分泌型糖蛋白。Geng等〔49〕实验发现，在GC发展过程中CHI3L1发生上调，并且与GC的浸润深度，TNM分期表现正相关性。CHI3L1与CD44v3结合可激活Erk，Akt和β-catenin信号传导，从而增强GC转移。Chen等〔50〕相关实验也证实，CHI3L1 可作为GC患者的潜在生物标志物和潜在治疗靶标。

GC早期诊断可为患者提供了内镜下微创切除的机会。在Min等〔51〕的研究中发现，正常人群标本中CHI3L1的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)为0.788，将血浆CHI3L1水平与临床因素结合，使AUC进一步提高至0.887。提示血浆CHI3L1可作为GC患者内镜下可切除的潜在生物标志物。

2.8Musashi-1 Musashi-1简称Msi-1，分子量为39 kD，Msi-1最早于果蝇中被检测出。已证实对感觉器官相关细胞的分化有一定影响。研究也发现Msi-1在人类胃肠道干细胞中均有一定表达。综上，Msi-1是胃肠道干细胞的潜在表面标志物之一〔52〕。

Kuang等〔53〕相关实验发现，Msi-1和增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞仅限于正常胃腺的峡部。GC中Msi-1和PCNA的表达高于高度上皮内瘤变(U=798.0，P<0.05；U=688.0，P<0.01)。且Msi-1的表达水平与淋巴结转移和肿瘤转移阶段呈一定影响关系(χ2=12.62，P<0.01；χ2=11.24，P<0.05)。其他大量实验〔54～56〕也发现胃黏膜不同程度病变、癌前病变(包括肠上皮化生和异型增生)和侵袭性GC中MUSASHI-1的表达均增加。由此可以发现，Msi-1(+)细胞可能在GC癌前病变或发生早期过程中起着决定作用，并可能参与GC侵袭和转移，可作为GC患者预后及诊断的标志。

2.9ALDH1 ALDH1由5.3×104个碱基对构成，主要分布于消化、内分泌及生殖系统中，而在大脑及小脑中还没有发现ALDH1的表达〔57〕。它定位于9号染色体长臂上的21区。

ALDH1存在6种亚型，不同亚型的表达与GC预后、侵袭及转移的密切性也不同。Wakamatsu 等〔58〕实验发现，ALDH1的表达与晚期临床病理因素显著相关。在原发性和转移性部位的GCSC标记比较表明，弥漫型淋巴结转移中ALDH1阳性率明显高于原发性肿瘤(P<0.001)；相关研究〔59～61〕表明ALDH1A1、ALDH1B1的高水平表达mRNA可能是GC中良好的预后标志物。高转录水平ALDH1A2、ALDH1A3、ALDH1L1会促进GC的进展和转移，提示也可作为GC预后不良生物标志物。同时Li等〔62〕研究表明，ALDH1A3和ALDH1L1的高表达与总体生存率(OS)恶化呈现明显相关，提示ALDH1A3和ALDH1L1是GC中ALDH1活性的潜在主要贡献者。因此，理论上不同高程度表达的ALDH1同工酶均可作为GC患者预后诊断的重要标志，但现实实验中还是以ALDH1A3和ALDH1L1运用较多。

2.10miRNA 微小RNA是一类长20～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA，通过降解核糖核酸或抑制翻译的方式进而调节一系列分化、发育等。

Peng等〔63〕实验发现miRNA-194具有致癌性，在GC中异常上调，并通过抑制融合抑制因子(SUFU)的表达而激活Wnt信号通路来上调肿瘤的增殖和迁移。但是在其他相关实验〔64～66〕结果显示miRNA-194在GC组织中表达下调。鉴于其结果的不一致，应综合因素进一步完善实验。虽然存在结果的不一致性，但实验结论均支持miRNA-194在GC中作为诊断或预后标志物的潜力。

大量实验〔67～70〕发现，miR-214可作为GCSC标志物。miR-214在GC中显着下调。大致机制是通过靶向肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中的成纤维细胞生长因子(FGF)9和调节GC细胞中的EMT过程来降低CAFs对GC的促肿瘤作用，提示CAFs中的miRNA-214/FGF9是GC治疗方法的潜在靶标。此外，Jiang等〔71〕通过对从GEO数据库获得的GC患者miRNA，mRNA和circRNA表达谱分析发现，共存在5种不同的表达谱(P<0.05)，即Hsa-miR-1，hsa-miR-142-3p，hsa-miR-95，hsa-miR-133a，hsa-miR-375。表达谱中前四者在GC中上调，最后一个在GC中下调。同时，相关实验〔72～74〕也发现，其他miRNA(miR-103a-3p、miR-124、miR-29b、hsa-miR-194等)均对GC组织具有一定影响。以上研究均提示各种特定miRNA具有作为GC预后生物标志物的临床潜力。

2.11SOX2 SOX2是Sox家族(B组B1亚组)成员之一，呈现单外显子结构，定位在3号染色体长臂。

近年来，越来越多实验〔75～77〕发现，SOX2的异常表达与GC的发生发展及不良预后有密切关系。在Wang等〔78〕和Chen等〔79〕实验也证实了在GC发展过程中，SOX2逐渐下调。SOX2水平低与病理分期和临床结果有关。多变量分析表明SOX2蛋白表达是GC的独立预后指标。同时，高SOX2表达水平的患者预示着治疗效果更好。Luo等〔80〕实验显示外源表达的SOX2抑制细胞增殖，SOX2过表达的细胞表现出细胞周期停滞和凋亡现象。迁移实验分析表明SOX2在GC细胞中具有抗转移作用。在SOX2过表达的GC细胞中细胞周期蛋白(CCN)D1和二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)被下调，并与SOX2诱导的抗癌作用有关。以上均说明SOX2是GC的有希望和有利的转移生物标志物，可被用于评估GC结果的新指标。

2.12Nanog 同源域蛋白Nanog定位于人染色体上12p13区，是维持多潜能胚胎干细胞的关键转录因子。现阶段证实其在绝大多数肿瘤中表达水平都明显提高，并对这些肿瘤的发生、发展及治疗的关键环节具有密切影响〔81,82〕。

刘劼等〔83〕通过检测(免疫组化SP法)，详细分析了GC、癌旁、癌前病变组织。实验显示Nanog阳性率在癌前病变组织(23.3%)<癌旁组织(38.8%)

2.13Oct-4 Oct-4是POU5F1基因(POU家族)编码的一种特异蛋白质。这种基因所表达的蛋白质可以作为未分化细胞的标记，并且是胚胎干细胞具有强大更新作用的关键原因〔86,87〕。

Javanbakht等〔88〕研究发现，肿瘤组织中的Oct-4 mRNA水平与正常组织相比呈一定上升趋势。其中淋巴结转移(P=0.001)等因素也会影响Oct-4的表达。提示Oct-4的高表达也与GC的进展和不良预后有关。田浩等〔89〕的研究中证实，Oct-4 mRNA高表达水平(P<0.001)能独立预测患者较差的OS。

DNA结合蛋白抑制剂ID-1(ID1)在肿瘤发展及胚胎干细胞自我更新速度和多能性中起着至关重要的作用。Li等〔90〕实验发现ID1在GC中起癌基因的作用，并通过靶向Nanog和Oct-4调节GC细胞的干细胞样特性。提示ID1、Nanog及Oct-4均可作为新兴治疗靶标的切入点。