基于oncomine数据荟萃分析探讨FOXM1在非小细胞肺癌中的表达与临床预后关系

王道猛 钱 斌 孟阳春 何小勇

肺癌是全世界发病率及死亡率均位于首位的恶性肿瘤[1-2]，肺癌的临床分型主要分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占80%[3]。在我国非小细胞肺癌仍是威胁人民健康的头号杀手，因此肺癌的防治工作仍是一项重要的关系民生的艰巨任务，目前非小细胞肺癌的治疗方式主要是以手术为主的多学科综合治疗，虽然提高了一部分病人的生存率，但总体生存率仍不容乐观，因为大多数肺癌出现症状去就诊时已处于中晚期，已发生了癌细胞的增值及迁徙[4]，因此从基因水平探讨肺癌的发生发展机制及与临床预后的关系，为肺癌的个体化治疗提供科学的依据是目前研究的热点之一。

FOXM1(叉头框转录因子M1)编码的蛋白质是参与细胞增殖的转录激活因子，编码的蛋白质在M期磷酸化并调节几种细胞周期基因的表达，例如细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白D1。目前的研究表明FOxMl基因的过表达与多种肿瘤的发生相关[5-8]，如肝癌、食管鳞癌、前列腺癌，肺癌等。

Oncomine数据库是目前全球最大的肿瘤基因芯片数据平台，在该数据库中已经收集了715个基因的表达数据，86 733个肿瘤组织和正常组织的样本数据。我们可以选择自己感兴趣的研究基因，在不做实验的情况下，荟萃分析自己感兴趣的基因与预后的关系。通过Oncomine数据库的基因表达及预后的挖掘，荟萃分析有利于增加说服力及提供客观的依据，本研究荟萃FOXM1和非小细胞肺癌预后关系，为进一步研究FOXM1在非小细胞肺癌发生增值迁徙中的作用机制提供线索和依据。

资料与方法

一、一般资料

在 Oncomine 数据库中挖掘相关信息具体过程如下：在此数据库中可根据自己的感兴趣的基因及肿瘤类型设定筛选和挖掘数据的条件。本研究中首先选择的筛选条件是：①Cancer Type：lung cancer；②Gene：FOXM1；③Data Type：mRNA 或 DNA；④Analysis type： cancer vs normal analysis；⑤临界值设定条件(P值<1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%)。

二、Kaplan-Meier Plotter分析患者生存情况

Kaplan-Meier Plotter数据库是一个可以分析目标基因与肿瘤预后相关性的数据库。我们通过Kaplan-Meier Plotter数据库选择FOXM1基因分析肺癌的生数据，观察目标基因与肺癌的预后关系。筛选条件如下：①“Cancer: Lung Cancer”；②“Gene: FOXM1”； ③“Survival: OS”。

三、统计学方法

利用t检验比较非小细胞肺癌与正常肺组织中FOXM1基因表达差异。利用Kaplan-Meier曲线进行生存分析FOXM1基因表达与患者生存的关系，不同组之间生存率的比较采用Log-Rank检验，检验水准α=0.05，P<0.05被认为差异有统计学意义。

结 果

一、FOXM1在Oncomine 数据库中不同肿瘤类型中的表达差异情况。

在所示的图中我们可以看到Oncomine 数据库总共收集到455项有关FOXM1在不同癌症中的研究分析，其中关于FOXM1表达的研究结果有78项具有统计学差异。 其中FOXM1高表达的研究75 项，低表达降的研究3项。

二、FOXM1在非小细胞肺癌中的表达情况

通过提取Oncomien数据库发现，2001年来共有11项研究12个数据集共包括1 178个样本涉及FOXM1在非小细胞非癌组织及正常组织之间表达的比较。组织学类型包括非小细胞肺癌的主要病理类型与正常组织比较。文章分别发表于Nat Med(2002)、Proc Natl Acad Sci USA(2001)、PLoS One(2010)、PLoS One(2008)、Cancer Res(2012)、Genome Res(2012)、Am J Pathol(2005)、BMC Genomics(2007)、Cancer Res(2005)、Sci Transl Med(2010)和TCGA。通过Oncomine数据库中荟萃分析进一步了解到，与正常组织相比，FOXM1基因在全部差异表达的基因中位数值排名为392.0，P=0.002，研究揭示FOXM1在非小细胞肺癌中呈现出高表达的状态。

三、进一步分析FOXM1在不同的研究中非小细胞肺癌和正常肺组织的表达差异情况

通过每一个芯片基因研究分析发现：利用箱式图比较发现FOXM1基因在不同的非小细胞肺癌研究芯片中均呈高表达，与正常组织相比显著增高(P<1E-4)。

在这12个数据集中，有9项研究显示FOXM1在非小细胞肺癌癌组织与正常组织表达差异有统计学意义，分别是SuLung[9](t=7.030，P=2.05E-9)，Garber Lung[10](t=7.273，P=3.83E-6 )，Beer Lung[11](t=8.092，P=2.07E-7)，Stearman Lung[12](t=6.747，P=1.01E-7 )，Hou Lung[13](t=9.640，P=1.05E-13)，Hou Lung(t=7.301，P=3.23E-7)，Landi Lung[14](t=8.572，P=6.82E-13)，Selamat Lung[15](t=9.550，P=7.25E-14)，Okayama Lung[16](t=7.233，P=4.60E-8)，其余3项研究差异无统计学意义(t=1.062，1.376；P>0.05)

四、FOXM1基因表达量与非小细胞肺癌患者生存的关系

FOXM1表达量与非小细胞肺癌预后关系究竟如何，我们通过Kaplan-Meier Plotter数据数据库我们输入目标基因及肿瘤名称绘制生存曲线分析发现FOXM1的表达量的高低与患者的总体生存率(overall survival, OS)有显著的关系。高表达组患者的总体生存率显著降低(HR=2.02，P<1E-16，图1A)。表达越高患者的总体生存率越差，表达越低患者的预后越好。分析结果揭示FOXM1表达量与非小细胞肺癌患者的预后相关。进一步研究发现FOXM1表达量在肺腺癌和肺鳞癌中后预后仍有显著的相关性：在肺腺癌患者中我们发现FOXM1高表达水平对总体生存率有显著影响(HR=2.4，P<1E-16， 图1B)，在肺鳞癌患者中同样我们可以发现相同的结论，其高表达水平对总体生存率有显著的影响(HR=1.33，P=0.018，图1C)。

讨 论

目前肺癌是全世界发病率及死亡率均位于首位的恶性肿瘤，肺癌的临床分型主要分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占80%。在我国非小细胞肺癌仍是威胁人民健康的头号杀手，因此肺癌的防治工作仍是一项重要的关系民生的艰巨任务，目前非小细胞肺癌的治疗方式主要是以手术为主的多学科综合治疗，虽然提高了一部分患者的生存率，但总体生存率仍不容乐观，因为大多数肺癌出现症状去就诊时已处于中晚期，已发生了癌细胞的增值及迁徙，因此急需从基因层面探讨肺癌的发生、转移、侵袭的机制及与临床特征。总体生存率的关系，发现新的有指导临床治疗及预后意义的基因，为肺癌的个体化治疗提供科学的依据是目前研究的热点。

FOXM1起源于叉头基因家族，它是细胞周期重要的调节因子[17]。FOXM1对于胚胎发育至关重要，FOXM1主要在增殖细胞中表达或由生长因子释放诱导。是典型的增殖相关转录因子，其刺激细胞增殖并表现出增殖特异性表达模式。在DNA合成前期、合成期和有丝分裂期表达显著增强，FOXM1通过促进进入S期和M期来刺激细胞周期进展。而且FOXM1是正确执行有丝分裂所必需的。FOXM1靶基因编码具有执行DNA复制和有丝分裂功能的蛋白质。在这种情况下，FOXM1在大多数肿瘤中充当原癌基因并且异常表达或突变导致肿瘤细胞的增殖，迁移和侵袭[18]。目前的研究表明FOXMl基因的过表达与多种肿瘤的发生相关[19-21]，如肝癌、食管鳞癌、前列腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌等。最近的研究已经将FOXM1视为肺癌的新型生物标志物之一，因为它不仅刺激细胞的增殖和生长，而且还与肺肿瘤细胞的高DNA复制率有关，许多研究评估了FOXM1的过表达与非小细胞肺癌患者生存的预后因素。但是研究结果尚无定论，尚未达成共识。因此我们在Oncomine数据库中荟萃分析FOXM1在非小细胞肺癌中的表达与临床预后关系。

Oncomine数据库是目前全世界最大的基因芯片平台，可以利用非营利性邮箱注册，在该数据库中荟萃分析不同肿瘤与目标基因的关系。本文充分利用该数据库的资源，利用研究同一目标基因不同研究者的数据增加样本量，在大样本量的前提下提高该研究结论的可信度及增加准确性。本研究首先通过Oncomine数据库挖掘FOXM1基因在头颈部癌，肝癌，肺癌，乳腺癌等常见肿瘤中的表达信息，结果显示在Oncomine 数据库总共收集到455 项关于FOXM1不同肿瘤中的研究，其中关于FOXM1表达的研究结果有78项具有统计学差异。 其中FOXM1高表达的研究75项，低表达降的研究3项。研究表明FOXM1在常见肿瘤中处于高表达状态与Carter等[22-23]的研究结果是一致的。进一步利用Oncomine数据库对肺癌相关研究进行荟萃分析发现，2001年来共有11项研究12个数据集共包括1 178个样本涉及FOXM1在非小细胞非癌组织及正常组织之间表达的比较。组织学类型包括非小细胞肺癌的常见病理类型与正常组织的比较。通过Oncomine数据库中荟萃分析深入挖掘进一步了解到，与正常的肺组织相比，FOXM1基因在全部差异表达的基因中位数值排名为392.0，P=0.002，研究揭示FOXM1在非小细胞肺癌中呈现出高表达的状态。

图1 FOXM1表达量与非小细胞肺癌预后关系；注：A：NSCLC(n=1 926)；B：adenocarcinoma(n=720)；C：squamous cell carcinoma(n=524)

KM Plotter数据库是目前全球比较通用的肿瘤生存相关的在线分析数据库，该数据库可以分析18 000多个癌症样本评估54 000多个基因对生存率的影响。其中包括500余例乳腺癌、1 800余例卵巢癌、2 400余例肺癌、360余例肝癌等相关的生存数据。在该数据库中我们可以分析54 000多个基因与2 400余例肺癌的生存状况，而且可以对肺鳞癌和肺腺癌进行亚组分析。本研究发现在KM plotter 数据库中提取数据揭示FOXM1与非小细胞肺癌的预后关系可见FOXM1表达量与非小细胞肺癌的预后显著相关。在研究中可见 FOXM1的表达量对患者的总体生存率(overall survival, OS)有显著的影响。低表达量的非小细胞肺癌预后显著好于高表达量的非小细胞肺癌预后 (HR=2.02，P<1E-16，图1A)。以上结果显示FOXM1表达量是非小细胞肺癌患者预后不良因素之一。我们在该数据库中进一步分析FOXM1表达量与肺腺癌和肺鳞癌的预后关系表明：在肺腺癌患者中，FOXM1高表达量对生存率有明显的影响(HR=2.4，P<1E-16， 图1B)，同样的数据提取方法，我们发现在肺鳞癌患者中，其高表达量对对生存率有明显的影响作用 (HR=1.33，P=0.018，图1C)。但仍需要增加样本量，通过分子生物学技术在蛋白和分子水平上对FOXM1在不同非小细胞肺癌组织类型中的表达水平及作用机制进行进一步分析验证。发现FOXM1通过何种通路调控非小细胞的增值侵袭作用，FOXM1有可能成为判断非小细胞肺癌预后的一个潜在生物标志物

综上所述，我们通过Oncomine数据库对FOXM1在非小细胞肺癌组织中表达的相关信息挖掘，我们拖过研究认为FOXM1在非小细胞肺癌组织中高表达，且与非小细胞肺癌预后相关。表达越高，患者的预后越差。利用数据库进行大样本分析，可以避免小样本研究产生的误差，FOXM1的表达与非小细胞肺癌的预后呈正相关。FOXM1有可能成为判断非小细胞肺癌预后的一个潜在生物标志物。FOXM1在非小细胞肺癌发生发展中的具体作用机制，仍需实验来进一步研究。