蜂胶中咖啡酸苯乙酯的合成及应用研究进展

张梅梅 谢英花 刘朝霞 张冬梅

摘 要： 蜂胶具有丰富而突出的生物活性，目前多被应用于食品和保健品中预防疾病。咖啡酸苯乙酯是蜂胶中主要的有效成分，因其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、免疫调节等多种药理作用而备受关注。咖啡酸苯乙酯在自然界含量偏低，传统提取方法费时费力、成本高，高效、大量制备咖啡酸苯乙酯成为研究热点。超声提取技术可得到纯度较高的咖啡酸苯乙酯;Knoevenagel缩合法适用于其工业化生产，收率较高。通过对咖啡酸苯乙酯的提取分离、合成方法以及药理活性等方面的最新研究进展进行分析，综述了咖啡酸苯乙酯的研究现状，并对咖啡酸苯乙酯的技术发展前景和研究动向进行了展望，提出今后应寻求实用性和通用性高、操作相对简便的制备方法并对其作用机制进行更加深入细致的探究。

关键词： 药物化学;蜂胶;咖啡酸苯乙酯;合成方法;药理活性

中图分类号：R284.2;S896文献标识码： A

doi：10.7535/hbkd.2020yx06007

Research progress on synthesis and application of

caffeic acid phenethyl ester in propolis

ZHANG Meimei， XIE Yinghua， LIU Zhaoxia， ZHANG Dongmei

（School of Chemical and Pharmaceutical Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China）

Abstract：

Propolis has been widely used in foods and health care products to prevent diseases due to its various and prominent biological activities. Caffeic acid phenethyl ester（CAPE） is the main active component of propolis， which has been widely studied for its various pharmacological effects such as antioxidation， anti-inflammation，

antitumor， antibacterial activities， immunovegularion， and so on. The content of CAPE is very low in nature， and the traditional extraction method of CAPE is time-consuming and costly， so efficient and mass preparation for CAPE has become a research hotspot. The CAPE with high purity can be obtained by ultrasonic extraction. Knoevenagel condensation reaction can be applied to its industrial production with high yield. Based on the analysis of the latest progress in extraction and separation， synthetic methods， pharmacological activity， and other aspects of CAPE， the research status of CAPE was reviewed， and the development prospect and the research trend of CAPE were provided， which are to explore the preparation method with high practicability and generality and relatively simple operation， and to conduct in-depth and detailed research on the mechanism of CAPE.

Keywords：

medicinal chemistry; propolis; caffeic acid phenethyl ester; synthetic methods; pharmacological activity

天然产物作为药物发现的重要来源，大多具有疗效好、副作用少等特点，是新药研究的巨大资源库。蜂胶是一种芳香树脂类物质，是由工蜂采集的植物树脂与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的具有黏性的固体胶状物，颜色为黄绿色、红色或深棕色，取决于来源和季节;在寒冷环境中硬而脆，在温暖环境中柔韧且黏稠[1-2]。蜂胶具有悠久的应用历史，早在公元前300年，古埃及人就将其作为防腐物质及防治疾病的药物来使用。蜂胶具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、保肝、免疫调节等多种生物活性[3]，现阶段被广泛用于医药、保健品、美容等领域[4]，具有较高的研究价值。

目前已从蜂胶中发现了200多种化合物，如类黄酮、芳香酸、萜类、醛类、醇类、脂肪酸和酯类、氨基酸、类固醇和糖等[5-6]，咖啡酸苯乙酯（CAPE）是蜂胶中的一种主要活性成分。受蜂胶产地的影响，CAPE的含量存在较大差异，如北温带蜂胶样品中大部分含有CAPE，而南美、巴西以及其他南部和熱带地区的蜂胶则基本不含该成分[7]。中国处于北温带区域，以河北省的蜂胶为例，CAPE的含量最为丰富（29.2 mg/g）[8-9]。GRUNBERGER等[10]从蜂胶中分离出CAPE，并证实其对肿瘤细胞有明显的抑制作用。NATARAJAN等[11]提出蜂胶中的CAPE具有选择性杀伤肿瘤细胞和抑制其生长的作用，标志着CAPE治疗癌症的实验室研究取得重大突破。随着现代医学技术的进步，CAPE的抗氧化、抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用被一一揭示[12-16]。

本文就CAPE的提取分离、合成方法及药理活性的研究情况进行综述，为CAPE的后续研究提供思路和参考 。

1 CAPE的发现

1982年，KALMAN在以色列卡梅尔山的蜂巢里收集得到蜂胶，胶体呈坚硬的棕色块状（直径约为2 cm），将其切碎，用80%（体积分数）乙醇水溶液（1.5 L， 2 d）萃取，抽滤并真空蒸发，得到金棕色固体。该提取物在50 mg/mL的质量浓度下对小鼠结缔组织（LTK）细胞显示出抑制活性。将乙醇萃取物依次用己烷、甲苯和乙酸乙酯萃取，将有机层进行干燥后进行LTK细胞抑制测试，发现乙酸乙酯萃取物相较于其他萃取部位在相同浓度下显示出至少高出2倍的细胞抑制活性[10]。1988年，GRUNBERGER等[10]报道通过制备型高效液相色谱从蜂胶中得到纯净的CAPE，并经核磁共振和质谱加以鉴定，化学结构见图1。该化合物在30 mg/mL质量浓度下对MCF-7细胞的抑制率为95%[18]。

随着科技的进步，相比传统的单纯溶剂浸泡提取法、加热回流提取法提取CAPE，索氏提取法、超声提取技术、超临界提取法及微波提取技术等更加省时省力[19-20]，其中超声提取技术由于其设备要求简单、操作方便得到广泛使用[21-22]。在用超声提取法提取CAPE时，利用超声助溶的原理，改变油脂分配系数，可以得到高纯度的CAPE[1]。

虽然在20世纪80年代早期未能纯化出CAPE并证实其对LTK细胞的抑制活性，但当时已证实对LTK细胞起作用的是脂溶性的蜂胶成分。随着分离技术的提升，20世纪80年代末终于纯化出CAPE并证实其对癌细胞的抑制活性。

2 CAPE主要合成方法

随着CAPE诸多药理活性的发现，人们对其关注度越来越高。但是由于CAPE在自然界含量偏低，造成提取成本高的问题，因此高效、大量制备CAPE一度成为研究热点。关于CAPE的合成，主要有酯化法、一锅法、Wittig及Wittig-Horner反应法、Heck反应法和Knoevenagel 缩合法，如图2所示。

2.1 酯化法

2.1.1 催化酯化法

如图3所示，通过化学催化法、酶催化法和偶合试剂缩合法直接合成CAPE。此类方法是最原始的CAPE合成方法，虽然方法简单但存在原料成本高、分离困难等问题[23-27]。

2.1.2 直接酯化法

如图4所示，以咖啡酸和2-溴乙基苯为底物进行直接酯化，相比于以咖啡酸和苯乙醇为底物催化成酯，该法收率明显提高，但是反应中引入溴乙基苯和HMPA，同样存在原料成本高且具有潜在的致癌风险[28-30]。

2.2 一锅法

如图5所示，以2-苯乙醇、米氏酸和3，4-二羟基苯甲醛为原料的一锅合成法[31]，该方法原料价廉易得，操作简单，但是催化剂哌啶和吡啶毒性较大，反应时间长（22 h），且后处理需要用盐酸中和吡啶和哌啶，收率也较低。

2.3Wittig及Wittig-Horner反应法

如图6所示，在Wittig反应中，以3， 4-二羟基苯甲醛和三苯基膦乙酸苯乙醇酯基氯化物反应，收率可以达到71%[32-33]。在Wittig-Horner反应中，3， 4-二羟基苯甲醛和亚膦酸酯反应，由于PO羰负离子较磷叶立德具有更强的亲核性，可以增强羰基的进攻能力，收率可以达到86%[34]。但是以上实验存在操作较繁琐、实验条件苛刻等缺点，使其工业化大生产受到限制。

2.4 Heck反应

图7为4-溴儿茶酚和丙烯酸酯通过Heck反应制备CAPE的新方法。经过选择保护基、优化Heck反应条件，最终以20%～40%的总收率获得CAPE[35]。

2.5 Knoevenagel 缩合法

1991年NAKANISHI 等[36]首次采用咖啡酸和2-苯乙醇直接酯化法成功合成了CAPE，但此方法及其后的合成方法普遍存在致命的缺点：1）原料成本高、分离困难;2）催化剂毒性大、收率低;3）实验操作繁琐、实验技能要求苛刻。2016年，黎常魁等[37]对“一锅法”进行了改进（见图8），用价廉无毒的甘氨酸/DMF代替毒性较大的哌啶/吡啶，改进后，不再需要盐酸中和吡啶和哌啶，只需简单水洗即可，此方法更适合工业化生产，更符合绿色化学的理念。米氏酸的用量大大降低，节约了原料成本，反应时间减少至5 h，收率提高至85.0%。

综上可知，咖啡酸和苯乙醇催化酯化合成CAPE，反应条件简单，但成本高，耗时长;碱催化卤代烃与酸反应，条件温和，但成本高，操作繁琐;以2-苯乙醇、米氏酸和3，4-二羟基苯甲醛为原料的一锅合成法中，3， 4-二羟基苯甲醛的市场价格仅为咖啡酸的 1/3 左右，合成成本低，收率较高，但需要用到毒性较大的哌啶吡啶;Witting反应条件温和，反应时间短，收率较高，但使用的三苯基膦价格昂贵，同时易对环境造成污染;Wittig-Horner反应中烷基磷酸酯简单易得，成本低廉，收率较高，但含磷试剂容易造成环境污染;Heck反应以4-溴儿茶酚和丙烯酸酯制备CAPE，同样存在原料昂贵、收率低的问题;Knoevenagel 缩合法对“一锅法”进行了改进，引入甘氨酸/DMF催化体系，时间缩短，收率提高，是目前较有潜力的工业化生产方法。

天然产物一直以来都是中医药的核心所在，但是受限于单组分自然界中含量低、分离难度大、提取成本高等問题。在过去的一个世纪中，天然产物全合成得到了长足的进步，采用了许多合成新方法、新理论和新分析仪器，极大地推动了有机化学学科的发展。基于此，使得CAPE合成成本不断下降，效率不断提升，为CAPE的后续研究提供了充足的保障。

3CAPE的药理活性研究

CAPE具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、保肝、免疫调节等多种生物活性，近年来对CAPE的研究主要集中在抗氧化、抗炎、抗肿瘤、解毒等方面。

3.1 抗氧化、抗炎作用

CAPE结构中含有儿茶酚结构单元，富电子的苯环区域可以清除自由基，达到抗氧化的目的。SUDINA等[38]通过研究CAPE对烧伤大鼠血清中脂质过氧化物的影响发现，CAPE可以清除活性氧化物质，抑制黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合成酶的活性，从而减少超氧化物歧化酶（SOD）的消耗，起到抗氧化作用。CAPE可以将氧化应激反应产生的过量自由基清除，并呈剂量依赖性上调肝组织谷胱甘肽、過氧化氢酶（CAT）、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶，达到抗氧化保护肝脏的目的[39-41]。国内有研究学者通过链脲佐菌素建立了糖尿病模型，发现CAPE对小鼠的心脏及大鼠的肝脏、肾脏的过氧化作用和抗氧化酶的活性有较大影响，明显提高了SOD和CAT的含量，抗氧化作用显著[42-44]。

MICHALUART等[45]报道了CAPE可以抑制前列腺素（PG）和白三烯的合成，PG是花生四烯酸在环氧化酶（COX）的催化作用下产生的，在炎症的形成过程中至关重要，CAPE通过抑制细胞膜上花生四烯酸的释放及抑制COX活性，阻止PG的合成，从而起到抗炎作用。

3.2 抗肿瘤作用

癌症是人类死亡的主要原因之一，研究各类抗癌药物已成为药物研究领域的热点[46]。1988年，GRUNBERGER等[10]对CAPE进行细胞抑制活性研究，首次发现其对乳腺癌（MCF-7）、黑素瘤（SK-MEL-28和SK-MEL-170）、结肠癌（HT-29）等有抑制作用，而对正常细胞无影响。

3.2.1 乳腺癌

2004年WATABE等[47]研究发现，在乳腺癌细胞MCF-7中，CAPE可通过Fas配体非依赖性机制激活Fas，诱导促凋亡因子B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）相关蛋白X及胱天蛋白酶活化。CAPE还可同时激活促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的P38和C-Jun氨基端激酶（JNK）。2011年，WU等[48]在研究CAPE对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB231的抑制作用时发现，CAPE可抑制肿瘤细胞的生长，但对正常的乳腺细胞几乎无作用，对转录因子NF-κB具有抑制作用，可以诱导MCF-7和MDA- MB231乳腺癌细胞周期阻滞，使细胞凋亡。

3.2.2 大肠癌及结肠癌

有研究表明，大肠癌的发生与Wnt/β联蛋白（β-catenin）信号通路的异常激活有关，致癌的关键是细胞质内游离的β-catenin的积累。β-catenin的功能主要介导细胞间黏附，在细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥重要的调节作用[49]。研究发现，CAPE可影响大肠癌细胞HCT116和SW480中Wnt/β-catenin信号通路，呈剂量和时间依赖性抑制作用，降低β-catenin蛋白的表达水平，表明CAPE是Wnt通路的抑制剂，可阻滞大肠癌细胞的生长周期和诱导细胞凋亡[49-50]。

此外，CAPE也可通过多种信号途径治疗结肠癌，见图9。薛文等[51]发现CAPE治疗结肠癌的作用机制可能与降低JNK-paxillin信号通路的活性有关，从而导致细胞凋亡。JNK是唯一可通过磷酸化激活paxillin78位点丝氨酸的激酶，因此，CAPE可通过抑制癌细胞中JNK信号通路阻止其核转位并阻断下游paxillin的激活，抑制癌细胞的增殖和迁移，且治疗结肠癌的效果呈剂量与时间依赖性。caspase-3是一种有效介导肿瘤细胞凋亡的因子。FAK-Ras-ERK是促进细胞增殖的重要通路，过度活化的酪氨酸激酶可激活下游信号途径，对抗细胞凋亡，促进细胞增生，最终促进肿瘤的发生发展。2015年，梁路昌等[52]发现CAPE发挥治疗作用的机制可能是阻断FAK-Ras-MAPK的异常增殖，加强caspase的表达，发挥抑制结肠癌细胞增殖和诱导其凋亡的作用，且CAPE的作用呈剂量依赖型。2013年，杨琨[53]发现CAPE呈浓度和时间依赖型抑制人结肠癌lovo细胞的增殖，作用机制可能是CAPE通过下调PI3K/AKT信号通路的蛋白继而上调凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-9，从而达到抑制结肠癌细胞生长的作用。

3.2.3 肝癌

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）是一种重要的细胞因子，它可以优先诱导癌细胞凋亡，而对正常细胞的毒性可以忽略不计。研究表明，CAPE可在Hep3B肝癌细胞中引起TRAIL介导的细胞死亡，同时可刺激死亡受体5（DR5）的表达。但当DR5经嵌合蛋白的处理后，可明显阻断CAPE/TRAIL诱导的细胞凋亡，这表明CAPE/TRAIL通过TRAIL与DR5的结合刺激了细胞凋亡。此结果表明CAPE可能在预防肝癌中发挥作用[54]。吞噬迁移蛋白-1（ELMO1）是一种高度保守的跨膜蛋白，参与调控细胞吞噬运动和细胞骨架重排作用等。ELMO1可抑制肝癌细胞纤维连接蛋白表达，导致细胞黏附能力降低，癌细胞之间易于脱离，转移结节形成，从而致使肝癌细胞发生转移。王紫燕等[55]发现CAPE可下调ELMO1的表达，抑制肝细胞生长因子（HGF），使人肝癌细胞系（HepG2）的侵袭和迁移能力下降。

3.2.4 前列腺癌

有研究发现，CAPE可通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B （PI3K/Akt）信号转导路径来抑制前列腺癌细胞的生长，并减轻由化疗或放疗导致的器官损伤和毒性[56]。在人前列腺癌细胞PC-3，DU145中，CAPE在非经典Wnt通路中可诱导受体酪氨酸激酶样孤儿受体2（ROR2）信号通路表达，抑制β-catenin表达及NF-κB的活性，而ROR2的过表达或敲除分别抑制或增强了PC-3细胞的迁移[57-58]。

3.3 CAPE对镉诱导毒性保护作用

镉污染和中毒是严重的环境问题和健康问题。镉是一种蓄积性强且毒性大的非必需重金属，在人体肾脏的生物半衰期可长达38年。多项证据表明，即便是低水平的镉，若长期接触，也会对肝、肾、睾丸、眼睛等器官造成损害[59]。因此，阐明镉的毒性机制，提供有效的药物或补充剂来减轻或抵消镉污染引起的毒性是非常迫切的。作为一种疏水性多酚酯，CAPE具有减轻镉损伤和调节自噬的功能。

2018年，DALEL等[60]发现氯化镉（CdCl2）可诱导HepG2细胞毒性并显著降低细胞活力。HAO等[61]研究发现CAPE可通过抑制HepG2细胞的自噬，显示出对CdCl2诱导的毒理学的保护作用。

3.4 CAPE的其他药理活性

CAPE还表现出其他方面的药理活性。例如：CAPE可通过调节小鼠和HepG2细胞中的JNK和NF-κB信号通路来改善胰岛素抵抗，显著改善葡萄糖消耗、葡萄糖摄取、糖原含量和氧化应激，并降低细胞中葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）mRNA的表达[62];CAPE对6-羟多巴胺（6-OHDA）诱导的SH-SY5Y细胞具有保护作用，具有成为预防帕金森病候选药物的潜能[63];CAPE可通过激活磷酸腺苷活化蛋白激酶/沉默调节蛋白（AMPK/SIRT1），MAPK/ERK及PI3K/Akt信号通路，保护PC12细胞免受顺铂诱导的神经毒性[64]。唐先高[65]研究发现，CAPE能抑制小鼠T细胞的过度活化和增殖，对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞有一定的抑制作用，双向调节巨噬细胞吞噬功能，表明CAPE有一定的免疫调节作用。

综上所述，CAPE表现出广泛的药理活性，尤其在抗肿瘤方面具有较高的研究价值和意义。后期可加强CAPE抗肿瘤机制的研究，拓宽其抗肿瘤治疗范围。还可以在现有研究基础上进行制剂的开发，与其他抗肿瘤药物联合应用，以期达到较强的抗肿瘤作用，同时降低抗肿瘤药物所产生的毒性。

4 结 语

天然产物是现代药物发展的重要来源，其具有生物相关性和结构多样性的优势，CAPE是蜂胶提取物的主要成分之一，因其具有众多确切的药理作用而应用前景广阔。CAPE可以从天然来源中提取得到，方法简单、污染低，但耗时长、效率低。化学合成法可以缓解CAPE规模化制备的难题，但其能耗高、污染环境。CAPE有多种不同的合成路径，研究人员一直致力于寻求实用性和通用性高、操作相对简便的制备方法，合成策略仍待改进，如反应原料、溶剂和催化剂等方面可进一步优化，绿色、高效的方法还需不断被发掘。

CAPE可以作用于多种信号通路和分子靶标，已被证实具有较强的自由基清除能力及抗氧化、抗炎、抗癌等多种药理作用，预示了其在炎症反应、心血管疾病、脑组织损伤、肿瘤防治、免疫调节等方面的应用潜力。虽然CAPE生理活性广泛，但目前关于CAPE机制研究主要集中在体外，且对于信号通路研究中的很多机理还不是很清楚，关于凋亡信号通路中的上游信号分子影响的研究也不多，需要进行更加深入细致的探究。此外，CAPE溶解度很低，对其生物利用度有影响，限制了在治疗和预防上的应用，今后可加强在制剂方面的研究。

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