西瓜种质资源表型精准鉴定技术方案

李娜 尚建立 周丹 王吉明 马双武

摘    要： 表型性状是遗传物质在特定环境下的具体表现，是进行种质/品种评价和遗传多样性研究的重要组成部分。笔者根据120份不同生态型的栽培西瓜种质在代表我国西北、华北和华南生态区的新疆昌吉、河南新乡和海南三亚进行2 a（年）的品质、形态特征和生物学特性等22个重要性状的表型精准鉴定，以及在枯萎病抗性鉴定、病毒病抗性鉴定、耐湿热鉴定的基础上，形成了规模化的西瓜种质资源表型精准鉴定方案，为西瓜种质资源分发利用、种质创新和基因挖掘提供参考，也可为西瓜新品种定向选育奠定基础。

关键词： 西瓜; 资源; 核心种质; 表型; 精准鉴定

中图分类号： S651 文献标志码： B 文章编号： 1673-2871（2020）11-94-05

为了解决西瓜种质表型性状鉴定标准不统一、鉴定数据不准确、利用不便和利用效率低等问题，笔者课题组开展了不同优势生产区域西瓜核心种质资源多年的表型精准鉴定和多年的抗性鉴定，基于笔者课题组老师主编或参与的《西瓜种质资源描述规范和数据标准》[1]和《农作物优异种质资源评价规范 西瓜》（NY/T 2387—2013）[2] 等著作或标准形成了规模化的西瓜种质资源表型精准鉴定技术方案，使表型数据的采集更加标准化，为西瓜种质资源分发利用、创新种质的筛选和创制提供参考，也为西瓜抗性和重要园艺性状的基因挖掘、全基因组分子辅助育种、分子标记辅助育种奠定坚实的基础。

1 试验材料

通过原有表型和基因型分析，从“国家西瓜甜瓜中期库”中的西瓜种质资源中选出120份不同生态型的栽培西瓜为材料。

2 田间试验设计及管理

选择能够代表我国西北生态区、华北生态区和华南生态区的新疆昌吉、河南新乡和海南三亚作为试验点，每个试验点分别鉴定2 a。采用催芽播种，春夏生长期地膜覆盖露地栽培（新疆昌吉试验基地、河南新乡试验基地2017年和2018年5—8月，海南三亚试验基地2017年12月至2018年4月、2018年12月至2019年4月），每份种质重复3次，随机区组设计，每次重复定植10株，行距2.0 m，株距0.4 m，双蔓整枝，自然坐果，每株留1果（同一种质不同重复间坐瓜节位尽可能保持一致），试验地周围设置保护行。试验地按当地肥水水平管理，果实充分成熟后采收，并按小区、单瓜进行性状调查和采种，种子及时晾干并干燥处理。

枯萎病抗性鉴定和病毒病抗性鉴定选择苗期鉴定方法，2018—2019年春季在中国农业科学院郑州果树研究所所部温室内进行。采用营养钵育苗，营养钵大小为8 cm×8 cm，每份种质3次重复，随机排列，每个重复50粒种子，每个营养钵5粒种子。

耐湿热鉴定在课题组实验室的恒温培养箱内进行。每份种质3次重复，每个重复30粒种子。

3 表型鉴定方案

本方案进行精准鉴定的表型性状，涉及到西瓜重要的抗性性状、品质性状、形态特征和生物学特性。抗性性状包括枯萎病抗性鉴定、病毒病抗性鉴定、耐湿热鉴定;品质性状包括中心可溶性固形物含量和瓜瓤质地;形态特征和生物学特性包括株型、雌花两性花、子房形状、主蔓长度、坐果距离、果粉、果实质量、果皮硬度、果皮底色、果皮覆纹形状、果实形状、瓜瓤颜色、果实长度、果实宽度、果形指数、果皮厚度、种子长度、种子宽度、种子厚度、种子千粒重。

参照《西瓜种质资源描述规范和数据标准》[1]，结合实际操作中的流程改良设计并完成本实验方案。

3.1 西瓜抗性鉴定

3.1.1 枯萎病抗性鉴定[3] 西瓜枯萎病病菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveurm）生理小种1菌种由本实验室使用菌土保存法保存。

菌株活化：用保存的菌土育苗，待瓜苗发病后，采用组织分离法分离病原菌。取病苗根茎接合部上下各约1.0 cm的茎部，清水冲洗晾干，切成约0.5～1.0 cm的小段，消毒后接种于灭菌的PDA培养基平板上，于25 ℃恒温培养箱中暗培养2 d后，光照培养约3 d至平板上长出紫红色孢子。将麦粒提前1 d浸泡，煮至熟透，滤干水分，分装，121 ℃灭菌20 min备用。在长满孢子的PDA平板上加入无菌水，轻轻摇晃使孢子散入水中。将含有孢子体的水倒入麦粒中，在28 ℃恒温培养箱培养至紫红色菌体长满麦粒（5～7 d）。

菌土准备：将长满尖孢镰刀菌的麦粒磨碎后，与灭菌的沙土1∶50（体积比）混匀备用。

种子准备：每份种质种子使用0.1%高锰酸钾溶液消毒后用湿布包好室温浸种16 h，甩干水分后，在33 ℃恒温培养箱催芽36 h。

接种鉴定：将准备好的菌土用营养钵装好，温室内加温苗床播种，设感病、抗病对照品种和保护行。抗性对照品种为‘Sugarlee（中期库号ZXG00261），感病对照品种为‘蜜宝（中期库号ZXG00216）。

病情调查：出苗結束后拔除畸形苗，统计出苗数，10 d后开始发病并记载发病情况，4周左右待感病对照品种达到感病水平后统计各重复的活苗数，计算死苗率。

死苗率/%=100×（出苗数-活苗数）/出苗数。

抗病性分级标准如下：

高抗（HR），0≤死苗率≤20%，赋值1;抗病（R），20%<死苗率≤40%，赋值3;中抗（MR），40%<死苗率≤60%，赋值5;感病（S），60%<死苗率≤80%，赋值7;高感（HS），死苗率>80%，赋值9。

3.1.2 病毒病抗性鉴定[4] 小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）病毒株由中国农业科学院郑州果树研究所古勤生博士惠赠。

种子准备：每份种质种子使用0.1%高锰酸钾溶液消毒后用湿布包好室温浸种16 h，甩干水分后，在33 ℃恒温培养箱催芽36 h后播种于装有灭菌基质的营养钵中。

接种鉴定：在西瓜幼苗子叶平展期进行接种。剪取携带植物病毒的叶片，放在研钵中并加入适量磷酸缓冲液研磨成汁液。浇透后，水喷湿叶面，在植物幼嫩的叶面上洒少许金刚砂，用纱布蘸取少量病样汁液在洒了金刚砂的叶面上朝同一方向轻抹2～3次。接种后盖膜保湿，遮阳网遮阴暗培养2 d。之后去掉遮阳网温室常规生长。设感病和抗病对照品种，抗病对照品种为‘PI 595203（中期库号ZXG001562），感病对照品种为‘Sugarlee（中期库号ZXG00261）。

病情调查：接种1周后开始观察叶片症状表现，接种35 d后调查发病情况：0级：无任何感病症状;1级：个别叶片褪绿斑或明脉;2级：轻度花叶，形状正常;3级：严重花叶，形状正常;4级：严重花叶，叶片轻微变形;5级：严重花叶，叶片严重畸形。

抗病性分级标准如下：

病情级数计算：RI=∑xini/N（RI-平均病情级数;i-病害分级的各个级别;xi-病害级别;ni-相应病害级别的株数;N-调查总苗株数），抗病性分级如下：

高抗（HR），RI<1.0，赋值1;抗（R），1.0≤RI<2.0，赋值3;中抗（MR），2.0≤RI<3.0，赋值5;感（S），3.0≤RI<4.0，赋值7;高感（HS），RI≥4.0，赋值9。

3.1.3 耐湿热鉴定[5-6] 每份种质种子用湿布包好室温浸种16 h，甩干水分后，分别放入高温处理（40 ℃）和最适发芽温度（33 ℃）的恒温培养箱催芽。从处理的第3天起每天统计种子的发芽数，至第7天各处理发芽种子数不再增加视为完全发芽。

发芽率/%=（7 d内正常发芽的种子数/试验种子总数）×100;

发芽势/%=（4 d内正常发芽的种子总数/试验种子总数）×100;

相对发芽率/%=（40 ℃处理发芽率/33 ℃处理发芽率）×100;

相对发芽势/%=（40 ℃处理发芽势/33 ℃处理发芽势）×100;

根据每份种质的相对发芽率和相对发芽势，分抗性级别如下：

强（相对发芽势、相对发芽率≥70%），赋值3;中（30%≤相对发芽势、相对发芽率<70%），赋值5;弱（相对发芽势、相对发芽率<30%），赋值7。

3.2 西瓜重要园艺性状精准鉴定

3.2.1 株型 开花坐果盛期，目测观察每株植株生长状态和枝叶的疏密程度，如图1：

丛生：（伸蔓晚，基部叶片多而紧密，蔓上叶片节间短、密，蔓分枝少、短），对照品种为‘日本短蔓（中期库号ZXG00143），赋值1;

紧凑（伸蔓正常，基部叶片少而疏，蔓上叶片节间较短、较密，蔓分枝较少、较短），对照品种为‘96B41（中期库号ZXG00152），赋值2;

疏散（伸蔓正常，基部叶片少而疏，蔓上叶片节间长、稀，蔓长），对照品种为‘郑引64号（中期库号ZXG00104），赋值3。

3.2.2 雌花两性花 开花坐果盛期，目测观察每株主蔓至少2朵雌花中有無正常雄蕊，如图2：

单性花（雌花柱头周围没有雄蕊），对照品种为‘96B41（中期库号ZXG00152），赋值0;

两性花（雌花柱头周围有雄蕊并能产生正常的花粉），对照品种为‘火星（中期库号ZXG00988），赋值1。

3.2.3 子房形状 开花坐果盛期，目测观察每株主蔓上至少2朵雌花子房侧面呈现的形状，如图3：

圆（纵径和横径基本相同），赋值1;椭圆（介于圆和长之间），赋值2;长（纵径明显大于横径，显得细长），赋值3。

3.2.4 主蔓长度 果实成熟采收时，用卷尺测量主蔓从子叶节到蔓顶端的最大距离，单位为m，精确到0.1 m。

3.2.5 坐果距离 果实成熟采收时，目测70%植株的坐果位置，并用卷尺测量主蔓子叶节到坐瓜节位之间的瓜蔓长度，单位为m，精确到0.1 m。

3.2.6 果粉 果实成熟采收时，目测和手拂的方法观察果实表面是否附着一层白色粉状物，如图4：

无（果实表面无白色的粉状物，用手拂过时没有果粉脱落），对照品种为‘抚州瓜（中期库号ZXG00386），赋值0;

有（果实表面有一层白色的粉状物，用手拂过时有明显的果粉脱落），对照品种为‘郑引64号（中期库号ZXG00104），赋值1。

3.2.7 果实质量 果实成熟采收时，用秤秤出成熟果实的质量，单位为kg，精确到0.1 kg。

3.2.8 果皮硬度 果实成熟采收时，用硬度计测量果皮阳面中部的硬度值，单位为kg·cm-2，精确到0.1 kg·cm-2。

3.2.9 果皮底色 果实成熟采收时，参照RHS植物比色卡上最接近代码的颜色特征目测确定果实表面最底层的颜色或覆纹间的颜色：

黄（FAN1 6 A），对照品种为‘黄金皮-3（中期库号ZXG00088），赋值1;绿白（FAN4 192 D），对照品种为‘河南三白瓜（中期库号ZXG00188），赋值2;浅绿（FAN3 134 C），对照品种为‘红宝石（中期库号ZXG00349），赋值3;绿（FAN3 140 A），对照品种为‘美国大花皮（中期库号ZXG00790），赋值4;深绿（FAN3 135 A），对照品种为‘火星（中期库号ZXG00988），赋值5;墨绿（FAN4 189 A），对照品种为‘PI 502319（中期库号ZXG02079），赋值6。

3.2.10 果皮覆纹形状 果实成熟采收时，目测的方法观察果实表皮的覆纹呈现的形状，如图5：

网纹（覆纹呈连续的细网状，经过的地方果皮底色可见，边缘不明显），对照品种为‘郑引65号（中期库号ZXG01517），赋值1;齿条（覆纹呈连续的窄条状，经过的地方果皮底色不可见，有锯齿状突出、边缘明显），对照品种为‘红宝石（中期库号ZXG00349），赋值2;条带（覆纹呈连续的宽条状，经过的地方果皮底色不可见，有斑状突出、边缘不明显），对照品种为‘All Sweet 3-1（中期库号ZXG00445），赋值3;放射条（覆纹呈不连续的条状，经过的地方果皮底色不可见，呈斑块辐射状、边缘不明显），对照品种为‘满堂红（中期库号ZXG01514），赋值4;斑点（覆纹呈不连续的斑点状，经过的地方果皮底色不可见，在果皮上不规则分布、边缘明显），对照品种为‘Moon and Star（中期库号ZXG01626），赋值5。

3.2.11 果实形状 果实成熟采收时，目测果实的形状，如图6：

圆（纵径和横径基本相同），对照品种为‘太阳西瓜（中期库号ZXG01304），赋值1;椭圆（介于圆和长之间），对照品种为‘PI 635594（中期库号ZXG01854），赋值2;长（纵径明显大于横径），对照品种为‘菲88-110（中期库号ZXG01307），赋值3。

3.2.12 瓜瓤颜色 果实成熟采收时，用刀沿果实中心纵切后，参照RHS植物比色卡上最接近代码的颜色特征目测确定果实纵切后瓜瓤所呈现的颜色，果实剖面拍照备查：白，对照品种为‘河南三白瓜（中期库号ZXG00188），赋值1;乳白（FAN4 N155 B），对照品种为‘PI 279462（中期库号ZXG02017），赋值2;黄（FAN1 5 A），对照品种为‘黄玫（中期库号ZXG00185），赋值3;橙黄（FAN1 17 B），对照品种为‘太原1号（中期库号ZXG00655），赋值4;粉红（FAN1 55 B），对照品种为‘96B41（中期库号ZXG00152），赋值5;大红（FAN1 45 AB），对照品种为‘郑引43号（中期库号ZXG00090），赋值6。

3.2.13 中心可溶性固形物含量 果实成熟采收时，用刀沿果实中心纵切后，用手持折光仪测定果实中心瓜瓤可溶性固形物含量，以%表示。

3.2.14 瓜瓤质地 果实成熟采收时，用刀沿果实中心纵切后，用品尝的方法根据口感的软硬、致密程度和汁液多少综合评价瓜瓤质地：

软（瓜瓤质地较松、汁液少），对照品种为‘红籽瓜（中期库号ZXG00637），赋值1;沙（瓜瓤质地松、汁液少），对照品种为‘阜阳3号（中期库号ZXG00154），赋值2;脆（瓜瓤质地实、汁液多），对照品种为‘96B41（中期库号ZXG00152），赋值3;硬（瓜瓤质地很实、汁液较多），对照品种为‘PI 174103（中期库号ZXG01946），赋值4。

3.2.15 果实长度 果实成熟采收时，用刀沿果实中心纵切后，用卷尺测量果实纵切面从基部边缘到顶部边缘之间的最大距离，单位为cm，精确到0.1 cm。

3.2.16 果实宽度 用卷尺测量3.2.15中选取果实纵切面与果实纵轴垂直方向两边缘之间的最大距离，单位为cm，精确到0.1 cm。

3.2.17 果形指数 根据3.2.15和3.2.16每个果实的长度和宽度数据，计算出果实的果形指数。果形指数=果实长度/果实宽度。

3.2.18 果皮厚度 用卷尺測量3.2.15中选取果实果皮阳面中部从外果皮到内果皮之间的距离，单位为cm，精确到0.1 cm。

3.2.19 种子长度 在果实成熟采收后，每个果实采收的种子中随机选取20粒饱满的种子，测量结束后放回混匀，再随机选取，共3次。用游标卡尺测量每粒种子喙部到尾部边缘之间的最大距离，单位为mm，精确到0.01 mm。60次测量的平均值作为该果实种子厚度的性状值。

3.2.20 种子宽度 用游标卡尺测量3.2.19中选取种子种面与种子纵轴垂直方向两边缘之间的最大距离，单位为mm，精确到0.01 mm。60次测量的平均值作为该果实种子厚度的性状值。

3.2.21 种子厚度 用游标卡尺测量3.2.19中选取种子平放时上下表面之间的最大距离，单位为mm，精确到0.01 mm。60次测量的平均值作为该果实种子厚度的性状值。

3.2.22 种子千粒重 在果实成熟采收后，每个果实采收的种子中随机选取20粒饱满的种子，测量结束后放回混匀。用千分之一的天平称重，单位为g，精确到0.01 g。20粒重换算为千粒重。3次测量值的平均值作为该果实种子千粒重的性状值。

4 数据处理及分析

每个试验点有3次重复，每次重复至少取5个样品。目测、品尝等感官质量数据的采集需具有专业知识的人员至少3人同时进行。所采集数量性状的数据，根据3次重复的观测值，使用Excel软件统计每个试验点性状的最大值、最小值、平均值、变异系数和标准差，特异的测量值做缺失处理，平均值做为该试验点种质的性状值。计算每份种质不同试验点性状值的平均数、变异系数和标准差，并利用SAS的Anova程序进行方差分析，判断试验结果的稳定性和可靠性。结合试验点当年的环境条件判断数据的合理性和特定性状数据整体差异的原因。生长不正常的年份和小区数据不予统计。

参考文献

[1] 马双武，刘君璞，等.西瓜种质资源描述规范和数据标准[M]. 北京：中国农业出版社，2005.

[2] 农业部种植业管理司. 农作物优异种质资源评价规范西瓜：NY/T 2387—2013[S]. 北京：中国标准出版社，2013.

[3] 李娜，王吉明，尚建立，等. 西瓜枯萎病生理小种1抗性QTL精细定位与InDel标记开发[J]. 中国农业科学，2017，50（1）：131-141.

[4] 尚建立，王吉明，马双武. 西瓜抗小西葫芦黄花叶病毒种质资源鉴定[J]. 中国瓜菜，2014，27（4）： 14-15.

[5] 周丹，王吉明，李娜，等.西瓜种子萌发期的耐冷性和耐热性[J]. 中国瓜菜，2018，31（11）： 26-30.

[6] 张力. 西瓜耐热性指标鉴定及材料筛选研究[D]. 南宁：广西大学，2014.