海菜花浸提液对2种沉水植物的化感作用

2020-12-21杨栋林陈坤平吴荻方轶潘巍侯丛林廖文雪

安徽农业科学 2020年22期

杨栋林　陈坤平　吴荻　方轶　潘巍　侯丛林　廖文雪

摘要以2种沉水植物密刺苦草、菹草为试验材料，用质量浓度5 g/L的海菜花浸提液处理，到期测定因此产生的化感作用。结果表明，在质量浓度5 g/L的海菜花浸提液处理下，菹草和密刺苦草的SOD活性、POD活性和脯氨酸含量均下降，丙二醛含量显著升高。叶绿素a、b含量也有不同程度的下降，其中，浸提液处理组菹草中叶绿素与对照组相比无显著性差异（P>0.05），浸提液处理组密刺苦草叶绿素含量与对照组相比有显著性差异（P<0.01）。说明海菜花浸提液化感物质对密刺苦草、菹草均有胁迫作用，胁迫作用的强弱顺序为密刺苦草>菹草。

关键词海菜花;菹草;密刺苦草;抗逆性;抗氧化酶;化感作用

中图分类号 Q945文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）22-0077-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.021

Allelopathy of Extracts from Ottelia acuminatas on Two Submerged Plants

YANG Dong-lin1，2，CHEN Kun-ping2，WU Di2 et al （1.Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection，Ministry of Education，Guilin，Guangxi 541004;2.College of Life Sciences，Guangxi Normal University，Guilin，Guangxi 541004）

Abstract The allelopathy were determined by using two kinds of submerged plants（Vallisneria natans，Potamogeton crispus） as experimental materials，and treated with the extract of Ottelia acuminata with a mass concentration of 5 g/L.The results showed that under the treatment of 5 g/L of Ottelia acuminata extract，the SOD activity，POD activity and proline content of allisneria natans and Potamogeton crispus decreased，and the MDA content increased significantly.The content of chlorophyll a and b also decreased in different degrees.The chlorophyll content in Potamogeton crispus in the extract treatment group was not significantly different from that in the control group （P>0.05），and the chlorophyll content in Vallisneria natans in the extract treatment group was significantly different from that in the control group （P<0.01）.It was shown that the liquifictive substances extracted from Ottelia acuminata had the stress effect on Vallisneria natans and Potamogeton crispus，and the order of the stress was Vallisneria natans > Potamogeton crispus.

Key words Ottelia acuminata;Potamogeton crispus;Vallisneria natans;Resistance;Antioxidant enzymes;Allelopathy

基金项目广西高校科学技术研究项目（YB2014056）;广西师范大学教育教学改革项目（2017XJGB40）。

作者简介杨栋林（1971—），女，广西玉林人，高级实验师，硕士，从事生物化学与分子生物学实验教学工作。*通信作者，讲师，硕士，从事细胞工程与分子生物学研究。

收稿日期 2020-04-11;修回日期 2020-04-29

化感现象（allelopathy）普遍存在于植物中，是指植物在生长发育过程中，通过根系分泌、茎叶淋溶、挥发或植物残体的腐烂降解等途径向外界环境释放的某些次生化学物质，对其他邻近植物或自身造成有利的或有害的影响[1-2]。近年来，国内外学者非常关注园林植物的化感作用，已成为研究领域的热点。科学合理地利用园林植物之间相互的化感作用，调节植物种间与种内相互关系，维持生态系统的稳定，调整和改善植物群落的相互配置，提高园林景观生態系统的可持续发展，减少维护成本，具有重要的理论和实践的意义[3]。

沉水植物被广泛应用于城市园林景观建设中，但是设计师往往只用美学观念来设计植物间的配置，而忽视了城市水生园林生态系统的相对封闭性，且在水生生态系统中，水生植物之间的化感作用更明显，设计师忽视了植物间相克相生的生态关系，不满足当代社会对园林建设的可持续性需求。近些年来研究沉水植物对藻类的化感作用较多，而沉水植物之间的化感作用效应相对较少[4-5]，研究如何处理好水生植物群落之间的相互关系，以便创造出更好的生态效益、具有可持续性强的景观，在园林设计中具有重要意义。

海菜花（Ottelia acuminata（Gagnep.） Dandy）为多年生水鳖科沉水、渐危种，国家二级保护植物，分布于云南西北部、贵州中部、广西西部和海南部分地区海拔2 700 m以下的湖泊湿地环境中，属多年生草本，花期一般在5—10月，在温暖地区全年可见开花，具有很高的观赏、食用和净化水质的价值[6-7]。目前，国内外学者对海菜花的研究除了大致的生境调查和少量的分类及民族学研究外，在生化水平上对其伴生物种（沉水植物）的化感作用效应鲜见报道。该研究从超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（POD）、脯氨酸、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）和叶绿素5个指标来分析海菜花浸提液对密刺苦草（Vallisneria natans）、菹草（Potamogeton crispus）的化感作用，為沉水植物在园林植物配置中提供相应的理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料试验于2018年1月进行，材料为海菜花、密刺苦草、菹草，3种植物均采集于广西壮族自治区桂林市永福县百寿镇（生境：村庄边的河流，砂砾质;109°44′12.00″E、3.25°06′47.99″N，海拔234 m）。选取长势良好、个头相当的植株，用冰桶带回实验室做进一步的培养及试验。

1.2 方法

1.2.1 浸提液的制备。

采集生长健壮、株高25～40 cm的海菜花，蒸馏水反复冲洗干净，全株于电热鼓风干燥箱（GZX-9140MBE） 80 ℃干燥48 h后，用粉碎机将其粉碎。称取20 g粉末浸泡在1 000 mL的蒸馏水中制成质量浓度为20 g/L的溶液，进行高温（47 ℃）振荡浸泡48 h，用孔径为0.45 μm的醋酸纤维酯滤膜过滤，滤液用蒸馏水稀释4倍，制成质量浓度为5 g/L的浸提液，存放到4 ℃的冰箱中备用[8]。

1.2.2 密刺苦草、菹草的培养。

将密刺苦草、菹草进行适应性培养7 d，放入300 mL的三角瓶，每瓶倒入200 mL浸提液，每瓶1株，对照组用等体积的蒸馏水培养，设6个重复。培养箱光暗比为16 h∶8 h，温度为25 ℃，湿度为70%，白天光照强度为4 000 lx，7 d后采样进行各项生化指标测定。

1.2.3 过氧化物酶（POD）活性的测定。采用愈创木酚氧化法[9]测定，以每分钟每克鲜质量（FW）样品吸光度变化值变化0.01时为1个活性单位（U）。取2 g植株叶片加入适量pH 5.5的磷酸缓冲液磨成匀浆，离心（6 000 r/min，10 min，4 ℃），收集上清液，沉淀用磷酸缓冲液再提取2次，收集上清液。取上清液0.1 mL加入2.9 mL磷酸缓冲液（0.05 mol/L）、1.0 mL H2O2（2%）、1 mL愈创木酚（1.0 mol/mL）于37 ℃水浴中保温5 min，加入2.0 mL三氯乙酸（20%），离心（5 000 r/min，10 min，4 ℃），470 nm测吸光度，其活性计算公式如下：

POD活性=ΔA470×VTW×VS×0.01×t（1）

式中，ΔA为吸光度，VT为提取酶液总体积，W为样品鲜重，Vs为缓冲液总体积，t为反应时间。

1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定。

采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法[9]测定，以每分钟每克鲜质量样品抑制NBT光化还原的相对百分率为50%时的酶量作为1个SOD活性单位（U）的反应体系，以U/g表示[9]。

取植物叶片1 g，加pH 7.8的预冷磷酸缓冲液2 mL，冰浴研磨成匀浆，离心（4 000 r/min，20 min，4 ℃），取0.05 mL上清液加入1 mL磷酸缓冲液（0.05 mol/L）、0.2 mL甲硫氨酸溶液（130 mmol/L）、0.2 mL氮蓝四唑（NBT）溶液（750 μmol/L）、0.2 mL EDTA-Na2溶液（100 μmol/L）、0.2 mL核黄素（20 μmol/L）、1.15 mL蒸馏水混合，总反应体系为3 mL，置于4 000 lx日光灯下反应20 min，560 nm测吸光度，其活性计算公式如下：

SOD活性=（ACK-AE）×V0.05×ACK×W×V1（2）

式中，ACK为光照对照管吸光度，AE为样品管的吸光度，V为样品液总体积，V1为样品用量，W为样品鲜重。

1.2.5 脯氨酸含量的测定[9]。

取植物叶片1 g，加5 mL 3%磺基水杨酸溶液，沸水浴10 min，冷却后取2 mL提取液加入2 mL冰醋酸、2 mL酸性茚三酮试剂，沸水浴30 min，冷却后加入4 mL甲苯振荡，静置，取上层液在520 nm波长下测吸光度[9]。

1.2.6 丙二醛（MDA）含量的测定[9]。

取植物叶片1 g，加入5 mL三氯乙酸（TCA，5%），研磨为匀浆，离心（3 000 r/min，10 min），取2 mL上清液加入2 mL硫代巴比妥酸（TBA，0.67%），沸水浴40 min，离心（3 000 r/min，10 min），取上清液分别在450、532、600 nm波长下测吸光度，其浓度计算公式如下：

MDA含量=6.45（A532-A600）-0.56A450（3）

式中，A450、A532、A600分别代表450、532、600 nm波长下的吸光度。

1.2.7 叶绿素含量的测定[10]。

取植株叶片1 g，加入适量的80%的丙酮、碳酸钙、石英砂磨成匀浆，离心（4 000 r/min，10 min），取0.5 mL上清液，加4 mL丙酮稀释，在663 、645 nm波长处测吸光度，其浓度计算公式如下：

叶绿素a含量=12.27A663-2.69A645（4）

叶绿素b含量=22.9A645-4.68A663（5）

式中，A663、A645分别代表663和645 nm波长下的吸光度。

2 结果与分析

2.1 海菜花浸提液对2种水生植物抗氧化系统的影响

抗氧化酶系统是需氧生物防御过氧化损伤的活性氧（ROS）清除系统，SOD、POD这2种酶均属于该系统的重要组成部分。在抗氧化酶系统中，SOD是唯一能清除植物细胞内活性氧自由基（O2·-）的酶，通常被作为植物遭受外界环境胁迫情况下的检测指标，它能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2·-），生成O2和H2O2，再由POD协助CAT一起催化清除H2O2，从而减少自由基对植物有机体的毒害。因此，抗氧化酶系统通常被认为是抵御外界逆境的防御系统，其酶活性的高低反映了植物在逆境条件下的生长发育状况及代谢水平[11]。

从表1可以看出，海菜花浸提液培养的2种水生植物（菹草和密刺苦草）与用蒸馏水培养的对照组相比，SOD和POD的活性均呈显著性下降，浸提液处理组菹草和密刺苦草的SOD活性分别为1.067和1.001 U/g，对照组SOD的活性分别为1.514和1.570 U/g，浸提液处理组与对照组相比，2种水生植物的SOD活性分别降低了41.9%（菹草）和56.8%（密刺苦草），均呈现极显著差异（P<0.01）。浸提液处理组菹草和密刺苦草的POD活性分别为94.100和26.030 U/（g·min），对照组POD的活性分别为155.333和200.000 U/（g·min），浸提液处理组与对照组相比，2种水生植物的POD活性分别下降65.1%（菹草）和668.3%（密刺苦草），均具极显著差异（P<0.01）。说明海菜花浸提液对这2种植物均有胁迫作用，在这2种沉水植物体中，SOD的耐受性比POD的耐受性强，与朱健等[12]的研究结果类似，在海菜花化感物质胁迫下菹草的抗氧化酶耐受性比密刺苦草强。

2.2 海菜花浸提液对2种水生植物脯氨酸含量的影响

由于脯氨酸（proline，Pro）亲水性强，能稳定植物原生质胶体及植物部分组织、系统的新陈代谢过程，能降低冰点，有防止植物细胞过度脱水的作用[8]。研究表明，逆境条件下，植物体内的脯氨酸含量会有所增加，是植物抵抗逆境的一种生理指标[13]。

从表2可以看出，2种水生植物（菹草和密刺苦草）对照组的脯氨酸含量显著高于浸提液处理组，浸提液处理组及对照组菹草中脯氨酸单位鲜重的含量分别为1.841×10-3和3.264×10-3μg/mL，浸提液處理组与对照组相比脯氨酸单位鲜重含量低77.3%，具极显著差异（P<0.01）。而浸提液处理组及对照组密刺苦草中脯氨酸单位鲜重的含量分别为1.326×10-3和2.731×10-3μg/mL，浸提液处理组比对照组低105.9%，具极显著差异（P<0.01）。在逆境条件下，脯氨酸的合成效率降低，积累量减少，抗逆性减弱，说明海菜花分泌的化感物质对密刺苦草、菹草具有胁迫作用。

2.3 海菜花浸提液对2种水生植物丙二醛（MDA）含量的影响

植物器官在逆境条件或是代谢过程中会产生活性氧（ROS），ROS的累积会导致细胞膜脂过氧化作用[14-15]。研究表明，丙二醛（MDA）是细胞膜脂过氧化的主要产物之一，MDA含量的高低代表着细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。

从表2可以看出，对照组植株MDA含量低于浸提液处理组的含量。海菜花浸提液处理组及对照组菹草中MDA含量分别为0.731和0.639 μmol/L，海菜花浸提液处理组与对照组相比MDA含量高12.6%，具极显著差异（P<0.01）。浸提液处理组及对照组密刺苦草中MDA含量分别为0.760 和0.553 μmol/L，浸提液处理组MDA含量与对照组相比高27.2%，具显著差异（0.01

2.4 海菜花浸提液对2种水生植物叶绿素的影响

叶绿素是吸收光能、转换光能的主要物质，其含量高低体现了植物光合作用的强弱。从表3可以看出，海菜花浸提液处理组中的2种水生植物（菹草和密刺苦草）叶绿素a和叶绿素b的含量均比对照组的叶片中叶绿素a和叶绿素b含量低。海菜花浸提液处理组及对照组菹草中叶绿素a含量分别为5.058 和6.341 mg/g，两组相比较无显著差异（P>0.05）。海菜花浸提液处理组及对照组密刺苦草中叶绿a含量分别为2.432和5.166 mg/g，海菜花浸提液处理组与对照组相比叶绿素a含量低112.4%，具极显著差异（P<0.01）。海菜花浸提液处理组及对照组菹草中叶绿素b含量分别为10.318和10.458 mg/g，两组相比无显著差异（P>0.05）。海菜花浸提液处理组及对照组密刺苦草中叶绿素b含量分别为4.844和8.985 mg/g，海菜花浸提液处理组与对照组相比叶绿素b含量低85.5%，具极显著差异（P<0.01）。说明密刺苦草中叶绿素含量受海菜花分泌的化感物质影响较大，而菹草中叶绿素含量受海菜花分泌的化感物质影响较小。

3 讨论与结论

氧在植物各代谢活动中起着重要作用，而细胞呼吸、代谢等活动会产生活性氧（ROS），在正常情况下抗氧化酶系统会消除过量的活性氧自由基（O2·-），使植物体内活性氧（ROS）代谢处于动态平衡。当植物遭受外界环境胁迫时，植物细胞体内O2·-会累加，引起细胞体内某些有机物损伤，从而破坏植物细胞、系统的稳态平衡[13]。在一定浓度范围内，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）能清除O2·-，消除细胞体内O2·-过多造成的伤害，但当细胞体内活性氧自由基数量超过一定的阈值时，自由基则会破坏抗氧化酶[16]。因此植物遭受不良环境条件影响时，细胞内的SOD、POD会有一定程度的升高;而当外界不良影响因素加强或持续作用时，SOD或POD将受到破坏，浓度下降，即低浓度的污染物对SOD、POD有激活作用，使植物适应不良环境;而高浓度污染物对SOD、POD有毒害作用[17-18]。该试验研究中2种受体植物的SOD、POD活性与对照组相比其浓度均明显下降，由此可知海菜花释放的化感物质对密刺苦草、菹草具有较强的毒害作用，其原因可能是：①受体植物体内电子传递链受阻;②膜脂过氧化，通透性改变。由于化感物质对抗氧化酶产生毒害作用，由此SOD遭受破坏，细胞内的活性氧自由基将不能还原成H2O2，细胞内的自由基大量累积，从而引发膜脂氧化作用，产出丙二醛（MDA），MDA含量越高，表明膜脂氧化程度越大，细胞膜受到伤害得越严重，细胞膜选择透过性的能力将会受损，细胞外的有害物质将会进入细胞，而细胞内的物质将会大量外流，电解质进出细胞的效率加大，由此导致细胞的衰老加速[19]。该研究中试验组菹草、密刺苦草的含量均明显高于对照组，说明海菜花浸提液对2种沉水植物具有一定的胁迫作用。脯氨酸在盐碱、低温等不利的条件下，可以起到一种渗透保护作用，可作为对盐、对水胁迫的抗逆性指标。在正常或是在环境胁迫下，植物体内脯氨酸的合成与某种酶（P5CS）有重要关系[14]，除此之外P5CS有利于提高脯氨酸的积累，改善植物的抗逆性[15]。该试验组中脯氨酸的含量低于对照组，而脯氨酸在逆境下其含量并未升高而是降低，其原因可能是POD、SOD遭受破坏，导致膜脂过氧化作用，生物膜系统受损，细胞膜选择透过性能力下降，海菜花分泌的化感物质进入细胞内影响了P5CS的活性从而抑制了脯氨酸的合成。一般研究认为，自由基活性氧（O2·-）的产生与抗氧化酶系统的防御作用、膜脂过氧化作用及细胞膜的渗透作用具有密切的动态平衡关系。当活性氧增加，会诱导抗氧化酶合成，而当外界物质胁迫下活性氧骤然大量增加则导致生物膜系统和抗氧化酶系统受到破坏，细胞膜的渗透性、选择透过性下降，酶的活性降低[20]。叶绿素的含量与光照、温度、pH、酶、活性氧等因素有关。该研究试验中菹草叶绿素的含量与对照组相比无明显差异，其原因可能是浸提液中的某些物质并未破坏菹草的叶绿体，菹草体内与叶绿素合成有关的酶没有受到损伤。浸提液处理组中密刺苦草叶绿素的含量明显低于对照组，其原因可能是浸提液中的某些物质破坏了叶绿体的膜结构，阻碍了光合系统中电子的转移，从而降低了叶绿素的合成或与叶绿体合成有关的酶活性，导致植物合成叶绿素降低，具体原因有待进一步研究。

该研究结果表明，海菜花浸提液对密刺苦草、菹草均有胁迫作用。海菜花分泌的化感物质的胁迫作用主要通过抑制受体植物的抗氧化酶系统、叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量来表现。在供体植物处理方式相同的情况下，不同受体植物化感效应不同[21]，而该研究表明海菜花浸提液对密刺苦草的化感作用强度高于菹草[22]，这与杨舒贻等[11]的研究结果相似。

植物之间的化感作用效应在植物群落的演替中具有重要作用，特别是在园林景观系统中，沉水植物的配置应避免植物的互相克生，应该更多地考虑植物之间的化感作用，在同一园林生态系统中采用相互相生的植物，以保证植物群落的稳定和可持续发展，发挥景观园林的生态环境效益和社会经济效益，避免植物群落单一化，植物的生长发育受化感效应的抑制影响，破坏原有设计景观，导致生态综合效益得不到可持续发展。

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