白囊耙齿菌锰过氧化物酶基因的表达和酶学分析

崔周磊， 王洪成， 武俊明， 陈华友

(1. 江苏大学 生命科学研究院, 镇江 212000; 2. 江苏中兴药业有限公司, 镇江 212000)

玉米秸秆较经济的处理方式是运用生物转化方法发酵处理，使之成为优质牛羊生物粗饲料[1]。未经处理的玉米秸秆口感粗糙且消化和吸收率较低，这是因为玉米秸秆中的木质素包被在纤维素的外层，这种紧密的网络结构阻碍了纤维素酶与纤维素的接触[2-3]，是秸秆饲料化生产过程中最大的难点之一。NCBI数据库显示，白囊耙齿菌Irpexlacteus(I.lacteus)有一整套木质素降解酶系统，包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)、漆酶、多功能酶以及其他协同酶，可在9 d内降解玉米秸秆中86.3%的纤维素、83.5%的半纤维素和74.9%的木质素[4]。锰过氧化物酶可以氧化木质素中的酚类结构单元及其他难以降解的化学结构，是一种高效的木质素降解酶[5]。自然界中的I.lacteus诱导性表达MnP，但生长速度缓慢，如果直接应用于玉米秸秆发酵会增加发酵时间和生产成本[6-8]。因此，本研究旨在将I.lacteus中的锰过氧化物酶基因转入到合适的表达系统中，进行MnP的异源表达，从而初步有效地了解锰过氧化物酶的酶学性质，以期为后续锰过氧化物酶基因导入生物安全性的饲用酵母工程菌中奠定基础，为秸秆饲料行业发酵技术进一步研究提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受态菌株购自上海生物工程有限公司。质粒pET-28a由本实验室保存。

1.2 培养基

LB液体培养基配制参考文献[9]。如需添加硫酸卡那霉素 (kan) ，待高压灭菌后冷却至50 ℃时,再加kan混匀，kan的质量浓度为50 mg/L。

1.3 主要试剂

TaqDNA 聚合酶、DNA Marker、PremixTaqTM购自宝生物工程(大连) 有限公司(TaRaKa); Protein Marker、质粒小量抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、琼脂糖及Ni-TED 琼脂糖纯化树脂预装重力柱(C600793)购自生工生物工程有限公司；ClonExpress© MultiS One Step Cloning Kit(C112-01)非连接酶依赖型的多片段一步克术试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；PCR引物合成和DNA测序由生工生物工程(上海)有限公司完成。锰过氧化物酶测试盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnSO4、FeCl2和CuSO4等分析纯试剂购于国药化学试剂有限公司。

1.4 重组锰过氧化物酶质粒的构建

将I.lacteus中的锰过氧化物酶基因序列(NCBI-GenBank: MH120207.1)导入信号肽分析软件 SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)，获得其融合一段含19个氨基酸的信号肽。去除信号肽后,MnP核苷酸序列为1 035 bp，经密码子优化后MnP基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

根据MnP序列和载体pET-28a序列，通过CE Design V1.04设计载体线性化引物P1和P2以及MnP线性化引物P3和P4(见表1)，以pET-28a为模板，用P1和P2进行PCR扩增出载体的线性化片段(PCR扩增条件：98 ℃ 预变性10 s；98 ℃ 变性10 s，55 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸30 s，30 个循环；72 ℃ 再延伸5 min)。以合成的MnP为模板，用P3和P4进行PCR扩增出MnP线性化片段(PCR扩增条件：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30 个循环；72 ℃ 再延伸10 min)。载体pET-28a的线性化片段与MnP线性化片段通过ClonExpress® MultiS One Step Cloning Kit试剂盒进行连接后转入E.coliDH5α感受态细胞中，涂布于kanLB平板，37 ℃过夜。挑取LB平板上的单菌落液体培养过夜，提取质粒。根据MnP核苷酸序列设计特异性鉴定引物P5和P6(见表1)，该引物在空载质粒和宿主菌基因组中无特异性结合位点，故可以进行菌液PCR鉴定阳性克隆。最后将阳性克隆送上海生工有限公司进行测序验证。

1.5 重组锰过氧化物酶的表达与纯化

将测序正确的重组质粒pET-28a-MnP转化E.coliBL21(DE3)感受态中，涂布于含kan的固体LB固体培养基，30 ℃倒置培养。挑取E.coli-pET-28a-MnP的阳性转化子接入含5 mL LB培养液中，30 ℃振荡培养过夜。按1% 接种量将过夜培养的菌液接入到100 mL含有kan的LB液体培养基，30 ℃，200 r/min转速，培养2.5 h左右，至OD600为0.6，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，继续诱导培养4.5 h。将诱导后的菌液在8 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，弃上清液，PBS溶液清洗细菌沉淀2次，向最终获得的细菌沉淀中加入5 mL细胞裂解液，充分悬浮菌体。在冰水浴条件下，利用超声破碎仪(功率200 W，超声时间6 s，间歇6 s，共破碎 20 min)破碎菌体。破碎完成后，4 ℃，12 000 r/min，离心20 min，收集破碎上清液。经0.45 μm滤膜过滤后，低流速将破碎上清液加入到结合缓冲液平衡过的Ni-TED 琼脂糖纯化树脂预装重力柱中，再用洗杂缓冲液漂洗5个柱体积，之后用分别含有20、50、100、150、200、250和300 mmol/L的洗脱缓冲液梯度洗脱，每种浓度清洗2个柱体积，收集洗脱液。将每一步采集的洗脱液用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其中的蛋白。同时以相同培养条件下的E.coli-pET-28a 菌体作为空白对照。

1.6 重组锰过氧化物酶的酶学性质

镍柱亲和层析分离纯化后的蛋白溶液为酶活测定液，锰过氧化物酶活性测定体系为3.2 mL反应体系：100 mmol/L琥珀酸缓冲液2 mL，4 mmol/L愈创木酚溶液0.7 mL，5 mmol/L MnSO4溶液0.2 mL，2.5 mmol/L H2O2溶液0.1 mL，粗酶液0.2 mL，在37 ℃预热20 min后，依次向比色皿中加入以上溶液，放入分光光度计中后马上加入0.1 mL H2O2溶液，启动酶促反应的发生，记录反应3 min内波长为465 nm处吸光度的差值。同时以煮沸灭活的粗酶液替代原酶液在同样条件下的反应为对照组。MnP酶活的定义为：每毫克蛋白每分钟催化1 nmol 愈创木酚为四邻甲氧基连酚所需要的酶量即为1个酶活力单位(U)。

表1 引物序列

1.6.1 重组MnP的最适温度和热耐受性

在不同温度条件(20 ℃～90 ℃，10 ℃为1个梯度)下用上述方法测定MnP活力，将最高酶活力记为100%，其他酶活力与最高酶活力的比值即为相对酶活力。在pH 3.0条件下，将酶活测定液分别置于不同温度(20 ℃～90 ℃，10 ℃为1个梯度)下保持1 h，测定相对酶活力，以确定热稳定性。

1.6.2 重组MnP的最适pH和pH值耐受性

在37 ℃反应条件下，在不同pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0)琥珀酸缓冲液中用上述方法测定MnP活力。将最高酶活力记为100%，其他酶活力与最高酶活力的比值即为相对酶活力；在37 ℃条件下，将酶活测定液分别置于不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0)保持1 h，以确定稳定性。

1.6.3 金属离子对重组MnP酶活力的影响

向酶活测定液中分别添加不同浓度的 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+和Cu2+金属离子，室温放置 30 min 后用于酶活测定。设定未添加金属离子的酶活性为100%，加入金属离子的酶活性折算成相对酶活，比较金属离子对酶活性的影响，每个处理重复3次，取平均值。

1.7 重组锰过氧化物酶对木质素的降解效果

将1.5节中的破碎上清液与粉碎后40目过筛的玉米秸秆、麸皮按料液1∶1混合，放置40 ℃恒温恒湿培养箱中静止反应，于反应24 h和48 h后分别取样，每个样品设置3组平行。酶解反应结束后，所有样品105 ℃烘干至恒重，然后采用Van Soest法测定木质素的变化值[10]。在相同情况下用E.coli-pET-28a 菌体作空白对照。

2 结果与讨论

2.1 重组锰过氧化物酶质粒的构建

MnP线性化引物P1和P2及载体线性化引物P3和P4经PCR扩增，分别获得了1 053 bp和5 277 bp的片段，结果如图1所示。经过ClonExpress®技术将合成MnP片段与PCR产物进行连接后转入E.coliDH5α。提取质粒后用特异性鉴定引物P5和P6进行菌液PCR验证，空白对照无条带，阳性转化子扩增得到了与目的基因大小一致(732 bp)的条带(图1)。最后重组质粒送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果正确，表明重组质粒构建成功，该质粒命名为pET-28a-MnP。

M: DL 10 000 Marker; 1: pET-28a; 2: MnP; 3: Blank; 4: pET-28a-MnP

2.2 重组锰过氧化物酶的表达与纯化

测序正确的重组质粒pET-28a-MnP转入E.coliBL21 (DE3)中，经0.5 mmol/L的IPTG诱导表达4.5 h后，破碎上清液用Ni-NTA亲和层析对重组酶纯化，纯化后SDS-PAGE电泳结果如图2所示。结合在镍柱上的蛋白在咪唑浓度为300 mmol/L时被洗脱下来，通过TotalLab quant 凝胶成像分析得出重组MnP的表观分子量约为43 ku。纯化后的重组酶经One DropTMOD 1000+测定其蛋白质量浓度为0.36 mg/mL，经锰过氧化物酶测试盒检测计算得到纯化后的MnP的酶活力为24 U/mg。

2.3 重组锰过氧化物酶的酶学性质

2.3.1 温度对重组MnP酶活力和热稳定性的影响

图3表明：在20 ℃～40 ℃，MnP活力随着温度的升高而增加；当温度超过40 ℃后，MnP活力随温度的增加而下降；当温度到达90 ℃时，MnP完全失去活力。这说明重组锰过氧化物酶的最适反应温度为40 ℃。在20 ℃～50 ℃时，MnP活力较稳定，其相对酶活保持在90%以上；当温度高于50 ℃后， MnP活力下降。这表明重组MnP在50 ℃内具有较好的稳定性。

M:Protein Marker; 1: pET-28a; 2: pET-28a-MnP; 3～8:washing buffer of 20, 50, 100, 150, 200, 250 mmol/L imidazole; 9: MnP washed by 300 mmol/L imidazole

图3 温度对重组MnP酶活力和热稳定性的影响

2.3.2 pH值对重组MnP酶活力和pH值稳定性的影响

从图4可以看出：当pH值在2.0～3.0时，随着pH值的升高，MnP活力逐渐增加；在pH值超过3.0后，MnP活力呈下降趋势；在pH 6.0时，MnP活力几乎为0。这说明MnP的最适pH值为3.0，且在中性条件下，该重组酶不具活力。另外，MnP活力在pH 2.5～3.5时比较稳定，其相对酶活力保持在90%以上。

2.3.3 金属离子对重组MnP活力的影响

从图5可以看出：Na+在1 mmol/L和5 mmol/L时，对MnP没有激活作用，但是当离子浓度达到10 mmol/L时，对MnP有激活作用，可以提高酶活性24%；K+在低浓度1 mmol/L时，对MnP有激活作用，但随着浓度的增高，对MnP有抑制作用；Ca2+和Mg2+在低浓度时，对酶活没有太多影响，当离子浓度提高到10 mmol/L时，对MnP有明显的激活作用，可以提高酶活性53%和30%；Zn2+在不同浓度下对MnP有不同的抑制效果，在5 mmol/L时，抑制酶活较明显；Fe2+和Cu2+在不同的浓度下，均有明显的抑制作用。

图4 pH对重组MnP酶活力和pH值稳定性的影响

图5 不同浓度金属离子对MnP活力的影响

表2 麸皮和玉米秸秆中木质素的含量及其降解率变化

2.4 重组锰过氧化物酶对木质素的降解效果

麸皮和秸秆经过破碎上清液酶解24 h和48 h分别取样进行木质素的测定结果见表2。使用Excel 2010和SPSS软件单样品t检验分析，木质素降解率=(空白对照组木质素含量-48 h酶解后木质素含量)÷空白对照组木质素含量×100。从表2可以看出，随着时间的增加，木质素的含量明显下降，表明破碎上清液对麸皮和玉米秸秆中的木质素有明显的降解作用。数据得出麸皮和玉米秸秆的木质素降解率分别为27.3%和35.8%。数据分析显示重组锰过氧化物酶对木质素的降解效果显著。

木质素的降解是多种酶系的共同作用结果，锰过氧化物酶只是其中的一种作用酶，且大多数是以同工酶的形式分泌胞外发挥作用的[11]。本实验中重组MnP的最适pH为3.0，在酸性条件下，相对酶活可以保持在90%以上，秸秆饲料在低pH值中更有利于储存[12]，因此该重组MnP具有应用前景。从离子分析可以看出：Ca2+的酶活促进作用较明显，Ca2+是微生物生长的必要元素，且能有效防止MnP发生热失活，有利于菌的生长及产酶[13]；Cu2+对MnP酶活力有明显的抑制作用，由于Cu2+是重金属离子，重金属对生物有毒害作用，可使蛋白质变性。从图5也可看出，随着Cu2+浓度的增加，MnP酶活抑制作用越明显[14]。另外，在其他报道中，Fe2+对很多真菌中的锰过氧化物酶抑制作用明显[13,15-16]，不同浓度的Fe2+对MnP酶活抑制作用程度不同，这与本实验的研究结果相同。

本实验选用的白囊耙齿菌是新测序的白腐菌，目前该菌的研究集中于对染料脱色处理[17-18]，在发酵秸秆饲料的领域研究较少。白囊耙齿菌的生长周期很长，在天然情况下锰过氧化物酶基因选择性表达，且分泌的锰过氧化物酶量较少。如果单独使用白囊耙齿菌进行饲用发酵，无法保证秸秆饲料的品质，同时也会影响产业周期。何平等[19]用12种诱导剂探究对I.lacteus产MnP的影响，这些诱导剂可以提高MnP的酶活力，但用于发酵秸秆饲料中，食品安全性遭到质疑。因此，将高效优质的木质素降解酶基因转入生物安全性的真核表达载体中表达，已成为一个新的研究方向。在未来，拟用大肠杆菌-酵母穿梭质粒表达系统[20]，将锰过氧化物酶基因导入食品安全级别的酵母表达系统，如毕赤酵母(Pichiapastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等，构造出若干组高比酶活锰过氧化物酶工程菌，为秸秆饲料行业的发展奠定基础。

3 结论

本实验将白囊耙齿菌中的锰过氧化物酶基因导入大肠杆菌进行异源表达获得了大量的锰过氧化物酶，经过镍柱纯化后获得较纯蛋白，对其酶学性质进行了初步分析。结果表明，MnP作用底物的最适温度为40 ℃，最适pH值为3.0，Ca2+、Mg2+在离子浓度10 mmol/L时对MnP酶活力有促进作用，Cu2+和Fe2+对MnP酶活力有抑制作用。重组酶在48 h内降解玉米秸秆中35.8%、麸皮中27.3%的木质素。该酶作为一种锰离子依赖的过氧化物酶，在pH 2.5～3.5时有稳定的酶活。这种特性有助于白囊耙齿菌在酸性条件下生存。目前，饲料在发酵过程中会产生大量的酸性物质，该酶的存在有利于饲料发酵后期木质素的降解，在饲料酶制剂领域具有广阔的应用前景。