INHA、INHBA 基因在单、多羔黔北麻羊不同组织的表达研究

2020-12-21周志楠韦仕南宋俊伟

中国畜牧杂志 2020年12期

张艳，敖叶，周志楠，韦仕南，陈祥*，洪磊，宋俊伟

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；3.贵阳市花溪区农业局，贵州贵阳 550025）

黔北麻羊是贵州省地方肉用山羊品种之一，有着独特的生境特征、体貌特征及生产、繁殖性能特征。黔北麻羊产肉性能好，繁殖率高，抗病力强，适应山区粗放饲养，具有较大的发展潜力，2011 年被列入《中国畜禽遗传资源志·羊志》，成为国家级新遗传资源[1]。

抑制素（Inhibin，INH）是由羊卵巢颗粒细胞和睾丸支持细胞分泌的糖蛋白激素，属于转化生长因子β（Transforming Growth Factor-β，TGFβ）超家族成员，在哺乳动物体内分布广泛。该家族主要调控细胞的生长与分化，由α亚基和β亚基（βA、βB）构成。抑制素α亚基（INHA）由α亚基二硫键连接而成，抑制素βA亚基（INHBA）基因则由α亚基和βA亚基所组成[2-3]。抑制素可协同激活素通过内分泌、旁分泌以及自分泌等途径特异性抑制垂体前叶合成并分泌促卵泡素（FSH）与促黄体素（LH）进而影响雌性动物卵泡的发育和排卵的数量，但抑制素分泌过多则会抑制FSH 与LH 的分泌[4]。有研究表明，INHA基因主要在卵巢颗粒细胞中表达，可能会通过调节其mRNA 表达量的变化影响从江香猪卵巢的生长和卵泡的发育[5]。此外，在小尾寒羊上的研究发现INHA基因AB 型的平均产羔数比AA型多0.57 只，在卵泡生长发育的各个阶段均能检测到INHA基因的表达[6]。山羊INHBA基因位于3 号染色体的第4 个外显子区域内，有研究表明INHBA基因可能是控制山羊高繁殖力性状的主效基因，或与之存在一定程度的连锁[7]。Hiendleder[8]发现INHBA基因对绵羊产羔数有着显著效应，INHBA基因也可以影响巴美肉羊的产羔数[9]。另外INHBA基因在牛卵泡颗粒细胞增殖、凋亡以及排卵过程中发挥重要作用[10]。目前，有研究显示INHA、INHBA基因不仅在动物进化中比较保守，同时也已被确定为细毛羊多胎性状的候选基因[11]，但两者在黔北麻羊中的研究鲜见报道。本实验以单、多羔黔北麻羊为研究对象，采用实时荧光定量PCR 技术检测目的基因INHA、INHBA在单、多羔黔北麻羊不同组织中的表达量，为进一步探究INHA、INHBA基因与黔北麻羊产羔性状的遗传机制及基因功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物黔北麻羊来自贵州省习水县富兴畜牧业有限公司，本实验选取经产单、多羔黔北麻羊母羊各6只进行屠宰，采集子宫、输卵管、垂体、下丘脑和卵巢等5 个组织，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要仪器紫外可见分光光度计，购自美国Thermo Fisher 有限公司；电泳仪（DYY-2C 型），购自北京市六一仪器厂；PCR 扩增仪（C1000 TouchTM）、实时荧光定量PCR 仪（型号为CFX96 Real-Time System）、凝胶成像系统（Universal Hood Ⅱ），均购自美国BIO-RAD 有限公司。

1.3 主要试剂 RNA 提取试剂TRIzol、液氮（-196℃）、三氯甲烷、0.5×TAE 缓冲液、异丙醇、75% 乙醇、西班牙琼脂糖购自贵州罗德宏信生物技术有限公司；荧光定量试剂2×Ts Master qRT-PCR Mix 购自擎科生物科技有限公司；cDNA 第一链合成逆转录试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 组织中提取RNA 及cDNA 的合成按照TRIzol法提取单、多羔黔北麻羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢组织中的总RNA，采用cDNA 第一链合成试剂盒对提取的组织总RNA 进行逆转录合成cDNA 第一链。将单、多羔母羊不同组织RNA 浓度分别定量至100 ng/μL，逆转录体系为20 μL：RNA 模板1 ng/μL，dNTP Mix 2.5 mM Each 4 μL，Primer Mix 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT（0.1 mol/L）2 μL，HiFi Script 1 μL，RNase-Free Water 6 μL。将以上体系加入无酶0.2 mL的PCR 小管，振荡混匀，短暂离心后，于PCR 仪上42℃孵育50 min，85℃孵育5 min。反应结束后，取1 μL 反应产物于超微量紫外分光光度计进行浓度和纯度检测，-20℃保存，备用。

1.4.2 引物设计根据GenBank 上传的山羊INHA基因与INHBA基因序列，设计INHA基因、INHBA基因荧光定量引物（Primer Premier 5.0 软件），以β-actin为荧光定量内参基因，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1。

1.4.3 实时荧光定量PCR 条件优化及反应运用qRTPCR 对INHA、INHBA基因在单、多羔黔北麻羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢等组织的表达水平进行检测，对退火温度及引物进行摸索并优化反应条件，确定最佳反应体系及退火温度。β-actin为内参基因，在每次实验时设计3 个相同水平的重复，最终确定实时荧光定量PCR 实验最佳条件，并将单、多羔黔北麻羊母羊的不同组织cDNA 等浓度稀释（500 ng/μL），qRT-PCR 反应体系为10 μL：qPCR Mix 5 μL、上下游引物（10 pmol/L）各0.3 μL、cDNA 1 ng/μL、ddH2O 3.4 μL。反应程序为：95℃预变性135 s；95℃变性15 s；退火30 s（INHA、INHBA基因最佳退火温度为56.7℃）；68℃延伸30 s；由机器自动设置（基础温度60℃ 每5 s 增加0.5℃扩增至95℃）进行熔解曲线分析。

1.4.4 统计分析采用2-△△Ct法分析INHA、INHBA基因在单、多羔黔北麻羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢中的差异表达量，用T 检验对INHA、INHBA基因在单、多羔黔北麻羊不同组织中的表达差异性并用单因素方差分析与最小显著性差异检验表达水平。

2 结果与分析

2.1INHA、INHBA基因在各组织中PCR 扩增产物的检测以合成的cDNA 第一链为模板对INHA、INHBA基因进行普通PCR 扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果可见目的产物条带透明、引物二聚体极弱，特异性强，与目的片段大小一致（图1），可用于进行下一步实验。

2.2 qRT-PCR 的扩增曲线和熔解曲线由图2、图3 可知，经过荧光定量PCR 反应后得到的扩增曲线和熔解曲线，在黔北麻羊各组织中INHA、INHBA基因扩增曲线呈现完好的“S”形状，曲线平滑未出现特殊趋势。循环阈值（CT）都处于扩增曲线的对数期，熔解曲线均呈单峰，峰值较好，无引物二聚体，特异性强，无杂峰。

表1 引物序列信息

图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2 INHA 基因扩增曲线与熔解曲线

图3 INHBA 基因扩增曲线与熔解曲线

2.3INHA、INHBA基因在黔北麻羊不同组织中的表达分析由图4 可知，INHA基因在单、多羔黔北麻羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢5 个组织中均有表达，在卵巢组织中表达量最高且表达高于其他组织（P＜0.01）。INHA基因在单羔黔北麻羊各组织中表达量依次为：卵巢＞输卵管＞垂体＞下丘脑＞子宫，卵巢表达极显著高于子宫、输卵管、垂体和下丘脑4 个组织，输卵管表达也高于子宫、垂体和下丘脑（P＜0.01），其余组织间的表达均未达到差异显著水平；INHA基因在多羔黔北麻羊中表达量依次为：卵巢＞垂体＞下丘脑＞输卵管＞子宫，垂体组织表达高于子宫和输卵管（P＜0.01）。单、多羔组间对比分析可知单羔卵巢组织表达高于多羔卵巢组织（P＜0.01），单羔输卵管表达高于多羔组（P＜0.01）；其中多羔组的垂体表达高于单羔组（P＜0.01），而多羔组下丘脑表达高于单羔组（P＜0.05），在子宫中表达差异未达到显著水平。

由图5 可知，INHBA基因在单、多羔黔北麻羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑、卵巢等5 个组织中均有表达，均在卵巢组织中的表达量最高且高于其他组织（P＜0.01）。INHBA基因在单羔黔北麻羊各组织中表达量依次为：卵巢＞输卵管＞子宫＞垂体＞下丘脑，卵巢表达高于其余4 个组织（P＜0.01），子宫、输卵管和卵巢组织表达均高于下丘脑组织（P＜0.01），而子宫表达高于垂体组织（P＜0.05），其余组织间均未达到差异显著水平。INHBA基因在多羔黔北麻羊各组织中表达量依次为：卵巢＞子宫＞输卵管＞垂体＞下丘脑，子宫表达量高于输卵管、垂体和下丘脑组织（P＜0.01）；输卵管和垂体表达均高于下丘脑（P＜0.05），其余组织间未达到差异显著水平。单、多羔组间进行对比分析可知，多羔组卵巢和子宫的表达量均高于对应单羔组（P＜0.01）；且多羔组下丘脑表达高于单羔组（P＜0.01）；其余组织间未达到显著水平。

图4 INHA 基因在单、多羔黔北麻羊不同组织表达差异

图5 INHBA 基因在单、多羔黔北麻羊不同组织表达差异

3 讨论

3.1INHA基因在黔北麻羊单、多羔性腺轴组织中的变化规律本研究通过qRT-PCR 技术对INHA基因在单、多羔黔北麻羊各组织中的表达进行了检测，均检测到了不同程度的表达，而郑杰等[12]研究也发现INHA基因在2 个不同山羊品种的卵巢、垂体均有表达，发现在单、多羔组内均是卵巢组织表达极显著高于其他组织，但2 个品种间无显著性差异的结果与本实验结果相反，可能基于不同品种及地理气候环境间的差异导致。靳兴涛等[13]研究发现INHA基因在多浪羊和卡拉库尔羊卵巢组织皆有表达，推测该基因可能定位于山羊的卵巢组织，而本实验发现INHA在单、多羔组黔北麻羊卵巢组织中表达量均最高，推测INHA基因可能与山羊的产羔率存在一定的相关性，但对其是否在黔北麻羊的卵泡发育过程中存在类似的功能还需进一步研究。Cui 等[14]研究发现，qRT-PCR 技术显示INHA主要在鸡第300 天的卵泡中表达，在排卵前第五大卵泡（F5）中发现最高的INHAmRNA 丰度，说明该基因的表达不是持续性表达，在排卵前的极高表达推测其可能有助于排卵，但本研究还未深入到卵泡发育及排卵阶段，对于山羊是否也存在类似的现象有待深究；易凡利等[15]研究发现，与未发情期相比，INHA基因在发情期香猪卵巢中的表达水平极显著升高，并且对卵巢组织有一定的调节作用；对于黔北麻羊而言，在不同卵泡发育阶段INHA基因的表达是否存在差异性表达，甚至是不表达，尚不能定论。本研究结果显示INHA基因在多羔组的卵巢组织表达极显著高于单羔组卵巢组织，与赵中权[16]研究发现INHA基因在山羊性腺轴卵巢组织中表达水平均最高的实验结果相同，说明INHA基因主要存在卵巢中，但对其在卵巢组织中具体发挥某种功能，以及是否有助于提高排卵率还需更深入的探究。

3.2INHBA基因在黔北麻羊单、多羔性腺轴组织中的变化规律 Chen 等[17]研究发现INHBA主要作用于母羊的卵巢组织，可能是影响母羊卵泡生长、排卵的相关基因；Yang 等[18]研究发现INHBA基因与绵羊繁殖性状相关，能直接或间接的调控mRNA 的表达；而在本实验中发现INHBA基因均在黔北麻羊单、多羔组的卵巢组织表达量最高，且大量在多羔卵巢组织中表达，推测其主要作用于卵巢组织，可能与黔北麻羊的高繁殖性能存在一定的关联性。索峰[19]通过qRT-PCR 方法检测出INHBA和INHA基因在巴美肉羊发情后1 h、12 h 和24 h 时间点子宫和卵巢组织中存在差异表达，表达量先升高后降低；在排卵期抑制素表达量变化较大，经产双羔巴美肉羊发情后比经产单羔巴美肉羊提前排卵，且排卵数量多于经产单羔母羊；INHBA基因在子宫中的表达量变化随卵巢变化而变化，说明INHBA基因在一定程度上也作用于子宫，但作者对于在子宫的具体功能未做深入研究；INHBA基因在经产多羔山羊子宫和卵巢组织中的大量表达，提示该基因可能有助于提高有效排卵率，从而间接影响着山羊的繁殖性能。Onagbesan[20]等通过qRT-PCR 检测发现在鸡的整个性成熟前直至18周龄，所有抑制素亚型的mRNA 均能够在鸡的睾丸中表达，但在卵巢中INHBA基因的表达量较低；这与本实验得出的结果相反，推测是不同物种所致，INHBA基因在单胃动物鸡与反刍动物黔北麻羊的卵巢中表达量存在较大差异，但具体机理还有待进一步研究。相反的是Safi[21]等通过qRT-PCR 检测发现鸡INHBA、INHA基因均在鸡卵巢组织中有表达；且在所有年龄段，卵巢中INHBA基因的表达均显著高于INHA基因。孙君卫[22]等研究发现INHBA基因随着卵泡的发育表达量逐渐升高，且在卵泡颗粒细胞中的表达量最高，这提示INHBA基因定位卵巢，并对卵泡发育有着重要影响。这些结果均显示INHBA基因在卵巢有表达，并一定程度上调控卵泡的生长发育；INHBA基因在黔北麻羊卵巢和子宫组织中表达，并且表达量均极显著高于单羔组，推测INHBA基因可能参与黔北麻羊卵巢组织的生殖调控且对多羔性状有一定程度的影响。