养殖对虾的主要病毒性疾病及其免疫防控措施（11）

○张喜贵孟长明陈昌福

（1河南省新乡市康大消毒剂有限公司，河南新乡 453700；2华中农业大学，武汉 430070）

②生物学功能Crustins具有抗菌活性和蛋白酶抑制剂活性。在WAP结构域中，N端带正电荷的氨基酸和疏水性氨基酸的正确定位可使蛋白质呈现出两性分子特征，而两性分子蛋白质可以插入至微生物细胞膜中破坏膜结构，从而起到抗菌作用。C端结构域显示蛋白酶抑制剂活性。与抗菌活性一样，蛋白酶抑制剂活性在甲壳动物免疫应答中起到一定作用，通过参与蛋白酶级联反应，防止蛋白酶的过量激活，从而避免宿主组织的自身损伤和抵抗病原微生物的感染。

（3）抗脂多糖因子（antilipopolysaccharid factor，ALF）

①种类与结构ALF最初发现于马蹄蟹体内，是一种具有抗菌作用和结合脂多糖（LPS）的多肽分子。此后，在白滨对虾、斑节对虾和中国明对虾中也发现ALF，并且虾类ALF与马蹄蟹ALF具有较高的同源性。ALF的相对分子量约为11.5KDa，由102个氨基酸残基组成，N端有20个高度疏水性氨基酸，在Cys32-Cys53间形成二硫键，二硫内有保守的正电荷氨基酸。

②生物学功能ALF能替换LPS分子中的Ca2＋，然后利用它的正电荷特性，结合到LPS的磷酸基团和羧基基团上，ALF与LPS结合后可以阻止启动炎性细胞因子的级联反应，减少组织损伤。此外，LPS是革兰氏阴性菌的内毒素，ALF与LPS的毒性成分类脂A结合后，可破坏内毒素的毒性作用。

（4）来自血蓝蛋白的抗菌肽

①阴离子抗菌肽Dexstoumieux-Garzon等从细角滨对虾（Penaeus stylirostris）和凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）的血淋巴中分离到3种具有抗真菌活性的阴离子抗菌肽。两种来源于细角滨对虾的酸性血浆，相对分子量分别为7.9KDa和8.3KDa，分别命名为 PsHctl和 PsHct2，PsHct1是PsHct2除去了部分残基所得到的短肽；另一种来源于凡纳滨对虾，相对分子量为2.7KDa，命名为PvHct。3种阴离子抗菌肽与其他类型的抗菌肽没有序列上的相似性，但与对虾血蓝蛋白的C端氨基酸具有95%～100%的同源性，表明它们是血蓝蛋白的裂解片段。阴离子抗菌肽与阳离子抗菌肽最大的区别是它们在生理pH条件下带负电荷，pI为5.65～6.54，分子结构中不包含铜离子结合位点。通过免疫检测发现受真菌感染的甲壳动物血淋巴中的阴离子抗菌肽浓度高于未被感染动物血淋巴中的阴离子抗菌肽浓度，说明阴离子抗菌肽与抗真菌免疫反应有关。同时，通过体外抑菌试验发现阴离子抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均未有抗菌活性，但对真菌显示出广谱的抗菌活性。

②Astacidin1Lee等应用阳离子交换层析和反相HPLC从淡水小龙虾（Pacifastacus leniusculus）的血淋巴中分离纯化了一种具有16个氨基酸残基组成的相对分子量为1.95KDa的抗菌肽，并命名为astacidin1。与小龙虾血蓝蛋白序列比较发现：它也是一种来源于血蓝蛋白C端的抗菌肽，但与同样来源于血蓝蛋白C端的3种阴离子抗真菌肽无同源性。astacidin1的一级结构序列为FKVQNQHGQVVKIFHH-COOH，不含糖残基及半胱氨酸残基。astacidin1的二级结构中含有一个B-折叠结构。Astacidin1对革兰氏阳性和阴性菌均具有抗菌活性，但切去其氨基端后，抗菌活性明显降低，说明astacidin1的氨基端部分是具有抗菌活性的主要区域。此外，脂多糖或葡聚糖可以刺激螯虾血蓝蛋白产生astacidin1。

③来自血蓝蛋白抗菌肽的产生机制已有研究表明，许多抗菌肽都是由较大的前体蛋白加工后形成的。如蟾蜍素I是从亚洲蟾蜍胃腺细胞中的组蛋白H2A经胃蛋白酶水解而形成的。从牛蜱肠中分离得到的一种3.2KDa抗菌肽是牛血红蛋白的分解片段。此外，用人胃蛋白酶裂解牛乳铁蛋白（Lactoferrin）后产生了具有更高抗菌活性的Lactoferricins片段。这说明金属结合蛋白能通过蛋白酶水解作用产生抗菌肽而参加免疫防御反应，也为来自血蓝蛋白的甲壳动物抗菌肽的发现提供了一个佐证，因为它们是由结合铜的血蓝蛋白产生的。

对虾遭受病原微生物感染后，其血淋巴中可检测到高浓度的PvHct，说明血蓝蛋白的裂解不是由于抽提过程造成的，而是由生物学信号所引起的。虽然血蓝蛋白的加工机制还不清楚，但推测它很可能是被来源于血细胞的酶所驱动的，因为甲壳动物在遭受病原微生物感染后，血细胞发生胞吐作用，胞吐作用有助于血蓝蛋白裂解酶的释放，从而使PvHct的浓度增加。astacidin1也是经过半胱氨酸样蛋白酶对血蓝蛋白加工而形成的。因此，加深对这些酶的研究有助于揭示甲壳动物的免疫应答机制以及血蓝蛋白在防御中所起的作用。

（未完待续）