香草乙酮在细胞水平对NOX-ROS-P38信号传导通路的影响

元荣荣,张 宇,魏丹丹,林旭红

1.河南大学淮河医院 内分泌科,河南 开封475000；2.河南大学淮河医院肾内科,河南 开封475000；3.河南大学淮河医院检验科,河南 开封475000

近年来,溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)的发病率呈上升趋势,流行病学统计,我国UC的患病率约为0.02‰[1-2]。目前,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)及活性氮在UC产生的病理生理机制中日益受到重视[3]。ROS可以激活丝裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的ERK、JNK和P38 MAPK[4]。而在肠上皮细胞系中,溶组织阿米巴能激活NOX2,增加氧自由基的生成,导致细胞死亡。因此,NOX2能增加氧自由基的生成,而氧自由基能激活或抑制P38 MAPK。但是对NOX2-ROS-P38-PGE2/NO信号通路在溃疡性结肠炎中作用的认识并不十分清楚,本实验探讨香草乙酮对NOX-ROS-P38信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 在细胞系THP-1(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库)中过表达NOX2，观察ROS及p-P38表达

构建pc DNA3.1-NOX2表达质粒,应用lipo 2 000 invitrogen转染细胞,一般待细胞密度达到90%时转染细胞,首先配制含0.8μg DNA的50μL Opti-mem无血清培养基及含2μL lipo 2 000的50 μL Opti-mem无血清培养基,混匀、室温放置5 min,然后将二者混合,放置20 min,转染期间,将24孔板培养基换成无血清培养基,每孔400μL,将混合液加入对应孔中,4～6 h后换成有血清培养基,实验组于次日更换成含有香草乙酮的培养液,对照组于次日更换成无香草乙酮的培养液,继续培养48 h后,应用细胞氧化应激活性氧(ROS)鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒(购自上海宝曼生物科技有限公司)检测ROS,并用Real time PCR检测p-P38基因的表达。

1.2 RNAi技术敲除细胞NOX2基因，观察ROS及p-P38表达

Invitrogen公司合成用于沉默NOX2的si-NOX2RNA dimer及作为对照的si-Scrambled RNA dimer,用细胞核电穿孔仪(Lonza Company)转染THP-1细胞,并与次日更换成含有香草乙酮的培养液,继续培养48 h后,应用动物细胞氧化应激活性氧(ROS)鲁米诺化学发光法定量检测试剂盒检测ROS,并用Real time PCR检测p-P38基因的表达。实验中同时设置转染GFP孔检测基因敲除效率。

1.3 SOD阻断ROS在细胞系THP-1中生成及低氧刺激ROS生成，应用Real time PCR检测p-P38及NOX2

实验分组,对照组不干预ROS,阻断ROS组和刺激ROS组。

1.3.1 SOD阻断ROS生成

将N-乙酰半胱氨酸(NAC)加入细胞培养液中,做MTT实验确定最佳NAC浓度,孵育1～2 h,利用DHE染色观察ROS被抑制情况。

1.3.2 低氧刺激ROS生成

将细胞置于低氧条件的仪器中(美国Biospherix低氧箱),其中1%O2、94%N2、5%CO2,对照组细胞处于21%O2、74%N2、5%CO2的条件下,应用DHE染色观察ROS生成。

1.3.3 Real time PCR检测p-P38及NOX2基因表达

从细胞中提取总RNA,用分光光度法测定所提取RNA的浓度,并用RNA电泳检测其完整性,然后进行m RNA反转录,最后PCR检测：采用premier 5.0设计p-P38和NOX2基因引物序列,将每个cDNA样品2μL 进行实时荧光定量PCR扩增,每个标本做复孔检测。热循环参数如下：95℃30 s 为第一阶段,一个循环；95℃5 s,60℃31 s为第二阶段,40个循环。用ABI 7500系统软件进行数据采集、分析。

2 统计学处理

数据以x-±s表示。使用SPSS 13.0统计分析软件,采用单因素方差分析的方法进行统计分析,方差分析后的两两比较采用S-N-K检验,P＜0.05,差异有统计学意义。

3 结果

3.1 在细胞系THP-1中过表达NOX2，ROS及p-P38表达

在细胞系THP-1中过表达NOX2,经香草乙酮培养后,ROS的表达下降,与对照组相比有显著差异,P＜0.01；经香草乙酮培养后,p-P38的表达下降,与对照组相比有显著差异,P＜0.05。

3.2 敲除细胞NOX2基因，ROS及p-P38表达

不敲除NOX2基因,经香草乙酮培养后ROS和p-P38表达减少,与敲除组相比,差异有统计学意义,P＜0.01,P＜0.05。

3.3 阻断和刺激ROS，NOX2及p-P38表达

阻断ROS后,3组NOX2的表达无统计学差异,P＞0.05。低氧刺激ROS后p-P38表达较对照组显著增加,与对照组比有统计学差异,P＜0.01；SOD阻断ROS后p-P38表达较对照组显著减少,与对照组比有统计学差异,P＜0.01。

4 讨论

研究[3-4]发现,氧化应激引起的机体免疫功能紊乱可能在溃疡性结肠炎的发病机制中有重要作用,ROS是氧化应激反应的分子基础。我们研究发现,香草乙酮治疗溃疡性结肠炎小鼠后NOX2活性及ROS生成被抑制,P38 MAPK磷酸化水平降低。因此推测NOX-ROS-P38信号通路在香草乙酮抗溃疡性结肠炎的分子机制中发挥重要作用。

本实验在THP-1细胞系中研究香草乙酮对NOX-ROS-P38信号通路的影响。实验结果显示,在THP-1细胞系中阻断ROS的生成,p-P38表达明显减少(P＜0.01),刺激ROS后,p-P38的表达明显增加(P＜0.01),但NOX2的表达均不受影响,说明P38在ROS的下游,NOX在ROS的上游。

在过表达NOX2时,应用香草乙酮培养细胞后,ROS和p-P38的表达均减少(P＜0.01,P＜0.05)。经香草乙酮培养后,NOX2基因不敲除组的ROS及p-P38的表达较基因敲除组的减少(P＜0.01,P＜0.05)。研究[5-7]发现,在中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞中,香草乙酮通过阻断NADPH氧化酶的活性而抑制氧自由基的生成。因此推测香草乙酮可能通过抑制NOX2的活性或抑制NOX2促进ROS的生成过程来抑制ROS的生成,进而抑制p38 MAPK磷酸化,但其具体作用机制尚待进一步研究。