嵌合抗原受体T细胞免疫疗法治疗胃癌的研究进展

刘志红，王 迅，左芦根

(蚌埠医学院第一附属医院临床医学院，安徽 蚌埠 233004)

《2015年中国癌症统计数据》显示，仅2015年一年中国新增癌症病例429.2万例，因癌症死亡281.4万例，相当于平均每天新增1.2万人，死亡0.78万人。中国国家中央癌症登记处(NCCR)估计的GC相关发病率和死亡率在癌症中排名第二，2015年导致大约67.9万人死亡[1]。目前对于胃癌的治疗仍以手术为主，放疗和化疗作为姑息治疗的方式。由于绝大多数GC缺乏特异的临床表现，患者在诊断时多已发展为晚期，加之肿瘤的扩散和转移，以致GC的5年生存率不到25%[2]。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法作为一种新兴的免疫治疗方法，以非MHC依赖的方式识别抗原，已经在B细胞恶性肿瘤中取得突破性的进展，而在实体瘤的研究仍在进行之中，且有望突破胃癌传统治疗模式的局限性，为晚期胃癌的治疗提供更好的治疗方案。

1 CAR-T细胞疗法概述

1.1 CAR-T设计的原理T细胞的活化依赖于双重信号途径，抗原刺激信号由TCR识别抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)或靶细胞表面呈递的抗原肽-MHC分子复合物(pMHC)而产生，经CD3向胞内传导，初步活化T细胞[3-4]。共刺激信号则由APC或靶细胞表面的共刺激分子与T细胞表面的相应共刺激分子相互作用而产生，完全活化T细胞，分泌细胞因子并表达细胞因子受体，完成T细胞的分化增殖。而CAR-T细胞以非MHC和APC依赖的方式，通过分离患者外周血T细胞，利用基因工程将识别肿瘤相关抗原(tumorsociated antigen，TAA)的胞外抗原结合单链可变区段(sing chain Fv domain，scFv)、跨膜共刺激结构域与T细胞的活化相结合，制备出CAR-T细胞，并在体外大量扩增，再回输到患者体内，从而特异性杀伤肿瘤细胞[5-6]。

1.2 CAR构成CAR主要由胞外抗原结合区、铰链区、中间跨膜区及细胞内信号转导结构四部分组成。胞外抗原结合区由单链可变区段scFv组成，赋予了其特异性识别TAA的能力。细胞内信号转导结构包含了T细胞活化区和相关共刺激区，在激活T细胞及介导T细胞免疫应答方面发挥重要作用[7]。CAR-T结构至今经历了四代的变革[8-10]。第一代CAR结构较为简单，主要通过CD3向胞内传导，但由于缺乏共刺激分子，无法使T细胞进一步。第二代CAR相对于第一代CAR来说，增加了一个胞内共刺激信号域(CD28或者CD137),通过双重信号途径完全活化T细胞，T细胞持续增殖并释放细胞因子，增强CAR-T杀伤肿瘤细胞的能力。第三代CAR整合了两个共刺激信号域，进一步加强T细胞杀伤肿瘤细胞的能力，但由于降低了激活T细胞的阈值，导致信号泄露，过度活化的T细胞释放大量细胞因子，从而引起“细胞因子风暴”的毒副作用。因此，大多数研究者更偏向于第二代CAR。第四代则在第三代的基础之上，新增编码CAR及其启动子的载体，调控T细胞的活化。

2 CAR-T细胞现阶段在临床的应用

2.1 血液系统疾病CAR-T细胞免疫疗法已在血液系统疾病中取得了突破性的进展，尤其是B细胞急性淋巴细胞白血病[11]。研究表明[12]以CD19为靶向的CAR-T细胞能有效杀灭B细胞性恶性肿瘤(CD19分子阳性)，包括CLL、复发难治性B细胞急性白血病、B细胞淋巴瘤。这一免疫疗法，有望突破传统治疗模式，给血癌患者带来福音Pandolfi等人[13]研究表明，用靶向CD19的CAR-T细胞治疗8例B-ALL，其中6人获得完全缓解，完全缓解率达75%。

2.2 实体瘤近年来CAR-T细胞疗法在实体瘤的研究也逐渐开展起来，取得了可喜的成果，但由于脱靶效应、肿瘤局部免疫抑制微环等限制的CAR-T在实体瘤中的应用。研究人员正努力寻找肿瘤特异性靶点，常见的研究靶点有：人表皮生长因子受体2用于治疗HER-2阳性的肿瘤，CEA用于大肠癌、胃癌等，间皮素用于肺癌、乳腺癌的治疗等[14-15]。

3 CAR-T治疗胃癌的主要靶点

3.1 人类表皮生长因子受体(HER-2)表皮生长因子受体2(HER-2)，也称为CD340，是EGFR家族的一员，由ErbB2原癌基因编码。 ERBB2在正常人体中仅微弱表达，而在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌和胃癌等患者中过表达[16]，为HER-2作为靶向胃癌的研究提供了理论基础。有研究人员[17]设计了一种含有抗HER2 scFv和CD137的CAR，通过临床级慢病毒载体系统转染到T细胞中。在体外实验中，通过将T细胞与原发胃癌肿瘤细胞1(PGCC1)一起孵育来验证CART-HER2细胞对患者来源的GC细胞的比活性。此外，当T细胞与原发胃癌肿瘤细胞2(PGCC2)相互作用时，检测到最低水平的细胞因子的表达。这些结果表明CART-HER2细胞可以特异性识别具有HER2高表达和低表达的GC细胞，使不同程度表达HER2的GC细胞激活。在体内用babl/c裸鼠构建HER2high + 7901细胞皮下异种移植肿瘤模型并分为两组，以小鼠的平均肿瘤体积(TV)和平均肿瘤重量(TW)为观察指标，实验组用CART-HER2细胞处理显著抑制肿瘤生长速率，而对照组中的肿瘤在注射NT T细胞后继续快速生长。该研究表明CART-HER2细胞在临床试验中对HER2阳性原代GC细胞和GCSCs(gastric cancer stem cells)具有特异，具有长期有效的杀伤肿瘤细胞活性。

3.2 间皮素(MSLN)间皮素(Mesotheline，MSLN)是一种膜蛋白，在正常间皮组织表达，在胃癌、间皮瘤和卵巢癌等表达[18]。Jiang Lv,Ruocong Zhao等人[19]用含有MSLN scFv、CD3ζ、CD28和DAP10细胞内信号传导结构域(M28z10)构建CAR，用以靶向MSLN阳性的胃癌细胞。实验设定了KATO III-GL，AGS-GL，BGC-823-GL和MKN-28-GL细胞系，并对四个GC细胞系上的M28z10T和GFP T细胞以及用作间皮素阴性对照的K562-GL细胞进行了18小时的杀伤测定，并测定细胞活力。结果显示，所有与四种GC细胞系共培养后，M28z10 T细胞比GFP T细胞具有更强的细胞毒性，而对于间皮素阴性K562-GL细胞，细胞毒性保持几乎相同。该研究表明M28z10 T细胞在体外对GC细胞具有较强的细胞毒性和细胞分泌能力，在不同的异种移植小鼠模型中诱导GC回归，并且与在腹膜内和肺转移GC模型中的GFP转导的T细胞相比，延长了这些小鼠的存活。

3.3 叶酸受体1(FOLR1)叶酸受体1(FOLR1)是糖基磷脂酰肌醇连接的蛋白质。据统计[20]FOLR1在超过三分之一的胃癌患者有FOLR1表达，使其可能成为胃癌靶向治疗的关键靶点。Minsung Kim 等人[21]设计了由抗FOLR1 scFv，CD28和CD3z组成的FOLR1-CAR。评估了CAR介导的T细胞对FOLR1阳性和阴性胃癌细胞的抗肿瘤活性。他们将胃癌细胞分为FOLR1阳性和FOLR1阴性细胞，当FOLR1-CAR Jurkat细胞与FOLR1阳性细胞共培养时，IL-2的水平显着升高。而当FOLR1-CAR Jurkat细胞与FOLR1阴性GC细胞共培养时，与单独培养的FOLR1-CAR Jurkat细胞相比，IL-2水平没有明显差异。FOLR1-CAR KHYG-1(一种天然杀伤细胞系)和FOLR1-CAR T细胞均以MHC非依赖性方式识别FOLR1阳性胃癌细胞，并诱导各种细胞因子的分泌并导致细胞死亡[21]。该研究表明靶向FOLR1的CAR KHYG-1/T细胞对FOLR1阳性胃癌细胞有明确的杀伤效果。

3.4 单克隆抗体(3H11)抗胃癌单克隆抗体(mAb3H11)由GC细胞系免疫产生，具有特异性强的特点，对正常组织反应弱，具有副反应小的特性。Han H等研究人员[22]收集用GC细胞免疫的小鼠，并使用细胞融合杂交瘤技术将其与鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合。通过GC细胞中的选择性培养和ELISA筛选获得产生mAb的候选杂交瘤细胞。在所有候选抗体中，实验结果表明mAb-3H11与GC细胞的结合具有高度特异性，并且在人GC组织中具有93.5%的反应率[22]。实验组构建以mAb-3H11的单链可变片段(scFv)为靶点的CAR-T细胞以杀死GC，与对照CAR T细胞相比，3H11-CAR-T细胞诱导强烈的T细胞细胞毒性并引发高水平的IL-2和IFN-γ产生，结果表明mAb 3H11具有GC诊断或靶向治疗的潜力。

此外，目前正在进行的CAR-T细胞治疗胃癌的临床试验存在不同的靶点[23]，临床试验NCT02349724、NCT01212887以CEA为靶点，NCT02713984以HER-2为靶点，NCT02617134以MUC1为靶点，NCT02725125、NTC03013712以EpCAM为靶点，随着研究的进展，特异性靶点的发现将为CAR-T疗法在为胃癌中的研究带来突破性的进展。

4 CAR-T治疗胃癌面临的问题

虽然CAR-T细胞免疫疗法在恶性肿瘤的应用得到了医学界的广泛认可，但仍然面临着诸多挑战。

4.1 脱靶效应由于肿瘤细胞缺乏特异性的靶点，CAT-T细胞杀伤肿瘤细胞的同时，正常器官组织细胞也遭受不同程度的损害。解决脱靶效应的关键在于寻找特异性靶点，并降低胞外单链抗体的结合力减轻免疫反应[24]，同时应用抑制性 CAR，调控CAR—T细胞的活性。近期Leonardo Morsut等研究人员[25]设计了一种基于Notchd的组装式受体(即SynNotch受体)，并利用一个特别的系统，使肿瘤上的一个抗原能够激活T细胞中的SynNotch受体，从而激活识别肿瘤表面第二种抗原CAR的转录，最终激活T细胞。依靠多种抗原来区分肿瘤细胞和正常组织细胞，使得CAR-T细胞精准靶向肿瘤细胞，从而更具适应性，有望突破特异性靶点的限制。

4.2 肿瘤免疫抑制微环境肿瘤免疫抑制微环境(Tumor microenvironment，TME)包括大量免疫细胞和各种免疫抑制分子以及细胞外基质等，它们和肿瘤细胞一起组成复杂的免疫抑制网络，因此CAR-T细胞必须穿过免疫抑制微环境，到达肿瘤细胞周围才能有效发挥其杀伤能力。有研究表明[26]联合使用CTLA-4或单克隆抗体阻断免疫检查点分子PD-1的抑制作用，能进一步强化CAR-T的抗肿瘤作用。Darrell J.lrvine等[27]以CAR-T为基础设计了一种“抗肿瘤疫苗”，在淋巴结区域提前激活T细胞以对抗肿瘤周围免疫环境的抑制，目前在小鼠实验中取得了理想的治疗效果。

4.3 细胞因子风暴细胞因子风暴(Cytokine release syndrome，CRS)是CAR-T细胞输入患者体内后产生的最严重的副作用，嵌合抗原受体与肿瘤表面相关特异性抗原结合，引发瀑布式的细胞因子释放，激活多种免疫反应。Ying Z等[28]构建了携带CD19-BBz(86)CAR-T细胞，并在25名ALL患者中进行了一项小型的早期临床试验。结果表明：在低剂量和中等剂量治疗的患者中，一半出现了临床缓解显著降低了CRS发生的风险。

4.4 CAR-T细胞的归巢CAR-T细胞回输到患者体内，需要穿过肿瘤细胞的细胞外基质并且克服免疫微环境对其的抑制，真正到达肿瘤细胞的数量并不容乐观，无法实现预期治疗效果。Smith[29]等合成一种生物“骨架”，将CAR-T细胞及一些营养物质包裹其中，有效延长了CAR-T细胞的生存时间，增强了对肿瘤细胞的杀伤效果，有望降低细胞归巢对CAR-T细胞的影响。

4.5 肿瘤干细胞肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)肿瘤干细胞是一种具有多向分化潜能、自我更新、能起始肿瘤增殖的细胞。CSC参与肿瘤侵犯、转移、复发及化疗的耐受[30]，这可能是肿瘤难以治愈、易复发转移的主要原因。因此，以肿瘤细胞为靶点的CAR-T细胞或许能从根源上消灭肿瘤细胞。

5 总结与展望

CAR-T细胞疗法自首次提出以来经历了不断的更新与发展，已在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了突破性的进展，而其在胃癌中的治疗仍处于初步阶段，寻找肿瘤细胞特异性的靶点及提高CAR本身抗原选择范围至关重要，突破肿瘤局部免疫抑制微环境也成为其CAR-T疗法的重要突破口。对于胃癌，CAR-T疗法将传统治疗、靶向治疗及免疫治疗联合杀伤肿瘤细胞，最终将为胃癌患者赢得更长久的生存时间及更高的生活质量。