植物组织培养污染成因分析及防控措施

梁明骅 曾雯雯 陆耀

(广西玉林农业学校，广西 玉林 537000)

植物组织培养是指在无菌环境下由人工控制植物的器官、组织、细胞及原生质体，将其与植物体分离后利用培养基进行培养，使之继续生长并发育成完整植株的过程。植物组织培养技术可以有效缩短植物的生长周期，减少生产成本，而且人工控制的培养条件为植物提供了优良的生长环境，可以有效避免外部因素对植物生长的影响。植物组织培养技术虽然拥有众多优势，但在培养过程中经常会产生污染，这种污染不易控制，一旦某个环节出现问题就容易使植物组织产生污染，进而导致整个实验失败。所以要想减少培养成本，提高经济效益，就要做好植物组织培养污染的防控工作。

1 植物组织培养污染的概念

植物组织培养始于20世纪初,是以植物生理学为基础发展起来的植物种苗繁殖技术。经过近1个世纪的发展,植物组织培养技术已在科学研究和生产实践上得到了广泛应用,特别是在植物的工厂化育苗方面。植物组织中含有大量的微生物，其特点是繁殖速度快，生长周期短。当植物组织进行长时间离体培养时就会出现污染现象，植物组织培养的操作并不复杂，但稍加疏忽就会引起组织培养的污染。这些污染通常出现在培养基附近，呈现出各种不同形状大小的痕迹，如霉变、云雾状、发酵泡沫状等。植物组织培养中的污染可能来自于内部因素，如真菌、细菌、酵母菌等多种微生物，也有可能来自于外部因素，如操作人员在操作过程中没有按照标准进行操作等。总之，植物组织在培养过程中产生污染的原因有很多，操作人员需要根据具体情况来分析，然后采取相应的防控措施。

2 防控污染的意义

植物组织培养产生的污染有着很大危害性。对植物组织培养有一定阻碍，如增殖速度降低、生长速度减缓等，严重情况下会导致植物死亡，培养实验失败，从而增加培养成本，降低企业的经济利益。防控污染可以有效促进植物组织培养技术的研究进展，构建完整的植物试管基因库，保护培养实验过程中宝贵的样本数据，避免受到污染的危害。另外，植物组织培养中含有大量的珍稀物种，这些物种的价值很高且获得不易，降低组织培养环节的污染，可以起到保护珍稀物种的作用。由此可见，防控污染的意义重大，政府、相关部门及操作人员要重视植物组织培养过程中的防控工作，加大研究力度，改善操作的不足之处，科学合理地开展植物组织培养工作。

3 植物组织培养污染的种类

3.1 材料带菌

材料带菌是指植物组织从植物体分离时就带有病菌，这些病菌可能来自于植物体的生长环境，通常情况下植物体的生长环境中都含有大量的微生物，因为其温度、湿度可以满足微生物的生长条件，一般病菌会分布在植物体的表面或周围。

3.2 初代培养污染

初代培养污染是指在进行第1代植物组织培养时产生的污染菌。这种污染出现的原因多是由于操作人员在进行实验操作时没有按照标准要求进行操作，导致病原菌接种在培养基上，经过几天以后病原菌就会在植物体附近大量繁殖，从而造成病原菌污染。初代培养污染一旦产生就会给实验造成严重影响，因为这种污染不好控制，清理过程较为复杂，所以操作人员要严加防控初代培养污染现象的产生。

3.3 继代培养污染

继代培养是指当植物组织在培养基里生长了一段时间后，培养基的营养物质产生枯竭，无法满足植物的生长需求，因此就需要将植物组织转移到新的培养基上。在植物组织转移的过程中原本没有病原菌污染的植物种苗也容易受到危害，培养基内出现的病原菌会感染到植物种苗上，从而产生污染现象[1]。

4 植物组织培养污染的成因分析

4.1 病原菌的分析

造成植物组织培养污染的主要来源是病原菌，其中包含细菌、真菌、酵母菌及防线菌等。细菌污染通常在接种后1～2d就会在培养基周围出现大量粘液状和发酵泡沫状的物体，这种病原菌耐高温高压，不易清除。真菌污染是由霉菌引发的，在培养基上接种5d左右会出现多种颜色的菌斑。

4.2 外植体的分析

外植体培养是指将植物组织与植物体进行分离后，在植物体外进行培养工作。外植体的选择对植物组织培养有着关键性的作用，因为外植体携带的病原菌不易清除，会污染材料内部，容易造成培养过程中的污染。操作人员在取材外植体时要考虑到气候等环境条件，一般植物茎尖处含有的病原菌较少，并且具有生长速度快、遗传稳定性强的优势，因此选择茎尖部位可以达到良好的培养效果。

根据外植体的取材地点和生长时期来说，要避免采集生长环境恶劣的植物体，植株越深入地下受到的病菌感染就越小。另外，还要避免采集成年或衰老的植物体，这类植株生长速度慢，新陈代谢功能差，容易遭受病原菌的感染。因此，在采集外植体时要进行多方面的考虑，尽量选取生长时期适合、不易被感染的植株进行培养实验[2]。

4.3 培养条件的分析

培养室的环境条件与污染率有着很大的关联，如果培养室的温度适宜、湿度较大，就会给病原菌提供有利的生长条件，从而产生较高的污染概率。植株自身生长环境的优劣也会影响组织培养过程的病菌污染率，操作人员在选取时要注重其生长环境，尽量选取光照充足处的外植体。培养基是繁殖病原菌的主要场所，培养基内不宜添加过多有利于病原菌生长的有机成分，且培养基要灭菌到位，合理控制培养基内部的温度、湿度及pH值，为植物组织的健康生长提供优良的环境条件。

4.4 操作人员的分析

培养过程中的污染多是来自于人为因素，操作人员只要严格按照标准流程进行操作，就可以有效避免污染现象的产生。人为污染的主要表现有以下几点：操作人员在进行接种工作时没有管理好自身的行为，不及时清洗、消毒自身的衣物，将细菌、霉菌带入无菌培养室内，从而造成污染；工具存放不当或灭菌不到位，植物组织培养的过程中需要使用大量的工具，如镊子、器皿、剪子、刀、培养皿等，如果操作人员使用完毕后没有及时清理保存，且使用前未充分灭菌，在下次使用时就会对植株造成污染。

5 植物组织培养污染的防控措施

5.1 选取适宜的外植体

植物组织培养污染防控工作要从外植体采集源头开始，不同环境下外植体的带菌程度不同，选择适宜的外植体，避免采集带菌量多的植株，可以有效减少组织培养过程中的污染。通常优良的外植体一般生长在光照充足的环境下，因此夏季是选取外植体的适宜季节，高温可以杀死大量的微生物和病菌，能够最大程度减少外植体本身携带的污染。

5.2 外植体灭菌处理

目前，在植物组织培养中普遍使用的灭菌处理方法有抗生素处理法、低温处理法、减压灭菌处理法等。其中，抗生素处理法是指当植物组织受到严重污染时采用抗生素进行喷洒，可以有效达到灭菌处理的目的。低温处理法将培养对象置于低温环境中，使部分病原菌不能存活，不过此类方法不适用于所有的植物体。减压灭菌处理的工作原理是通过减压操作吸取植物组织中的气体，使消毒剂进入到组织内部中，从而达到灭菌处理的效果[3]。

5.3 培养条件的控制

造成组织培养过程中产生污染，多数情况下是操作人员没有控制好培养条件。在培养基方面，操作人员要严格进行灭菌工作，防止灭菌不彻底造成病原菌繁殖的现象，并且要及时去除培养基中的有机成分，有机成分是提供微生物生存的有利条件，去除有机成分可以大大减少污染率。另外，在选取培养容器时要尽量选择密封性能良好、体积较小的容器，因为此类容器可以有效减少污染产生的可能性。

5.4 严格按照标准操作

操作人员要意识到标准操作的重要性，严格规范自身的行为，定期清理消毒衣物和鞋子，避免携带病原菌进入无菌接种和培养室内。并且要保证工作台处于严格的无菌状态，在接种后及时做好卫生工作，可以用新洁尔灭溶液进行地面、墙壁和门窗的消毒，尤其要注意容器检查，避免出现容器密封不严或破损的现象。