激光捕获显微切割技术在生物学方面的应用*

陈璐瑶，吴钧坚，龚琳，赵靖悦，陈由强，何文锦

（1.福建师范大学生命科学学院海洋生物医药与制品产业化开发技术公共服务平台，福建 福州 350117； 2.福建师范大学南方海洋研究院福建省微藻种质改良工程技术研究中心，福建 福州 350117）

机体组织是由许多功能和形态不同的细胞构成，其中形态功能相同的细胞相互粘附在一起，并且这些细胞各自又与周围的其他细胞或其他组分相互粘附，但这些细胞或组织都有各自的特异性。即细胞之间存在异质性，即使表型相同，细胞的遗传信息也可能具有显著差异[1]。不论植物、动物，它们都有着复杂的组织结构，以前，分子水平的研究只能通过解剖镜或其他手段分离出植物或动物的某个组织，但不能精确到某类细胞。为了分析研究不同组织和细胞间的异质性，就需要将不同类型的细胞分离出来，然而，由于常规分离单个细胞或单个细胞群难度大，而且在这个过程中容易被污染，所以一直无法成功分离。

随着技术的进步，出现了三种分离目标单一细胞类型的方法，即：体外细胞系培养、免疫磁珠分选和显微切割[2,3]，相对于其他两种方法，显微切割技术（LCM）可以更深入地了解基因表达情况，因此更被广泛地应用于分子生物学水平上的研究。LCM的出现很快解决了细胞异质性的问题，它可以在显微镜下直接确定并且分离出目标细胞。目前，显微切割技术在单一性以及准确性、保护其他分子等方面已经有了很大的改善，因此，该技术在生物学领域单细胞捕获以及下游研究中是一个不可或缺的手段。凭借强大的技术和适当的应用，该技术从自然组织栖息地中生长的细胞提供了前所未有的细胞生物学见解。

本文就LCM的发展历程以及在生物学方面的应用进行了综述，并且对现存的问题以及发展进行讨论。

1 激光捕获显微切割技术

激光捕获显微切割（Laser capture microdissection，LCM） ，是利用显微镜直接从冰冻或石蜡包埋切片中确定、分离获取目标细胞的技术[4]。激光显微切割整体系统除了常见的LCM外，还有激光显微切割及压力弹射（LMPC）。两者结合成功解决了细胞之间存在差异的问题，因其具有迅速、准确、简易、特异性强等优点，逐渐成为生物学领域中分子水平上研究的一个关键工具。

LCM基本原理是通过低能红外激光脉冲激活热塑膜——乙烯乙酸乙烯酯膜（ethylene vinylacetate，EVA），利用显微镜直视，然后有选择地将目标细胞粘到该膜上[5]。

2 发展历程

显微切割的发展经历手工显微切割、机械辅助显微切割、液压控制显微切割和激光捕获显微切割4个阶段[5]。LCM是目前最常用的自动化程度最高的新兴设备，它可以精确分离出目标样品，然后对其进行更深入的研究。

早期，人们采用手工显微切割，该方法不仅耗时，而且操作复杂，更重要的是在此过程中造成样品污染[6]。初期的LCM，它是利用发射出来的激光直接将非目标细胞或细胞群灼烧，留下所需的组织，但该技术仍然不够成熟，比如无法确定所需细胞是否纯净，获得的目标细胞可能混入其他的组织。1996年，美国国立卫生院（National Institute of Health，NIH）国家肿瘤研究所的Michael等开发出激光捕获显微切割技术[7]。之后，美国Arcturus Engineering公司研制出LCM系统，并进行商品化的销售[8]。应用该技术可以解决之前细胞不纯净的问题，通过显微镜直接快速准确地获取单一的目标细胞群或细胞。近年来，LCM快速发展，以其迅速、准确、自动化、灵活性等优点广泛应用于各个领域，尤其是需要研究的细胞很难从样本细胞中单一纯净地分离时，或细胞分布不均匀呈现散状时，显微切割技术显得尤为重要[9]。

3 激光显微捕获切割技术的应用

3.1 在肿瘤方面的应用

LCM与之前的显微切割技术相比较，已经有了突破性进展，是目前最广泛的分离纯化组织和细胞的新兴技术。最初LCM的出现解决了细胞异质性的问题，是生物科学领域分子水平等方面的一大里程碑。目前LCM已广泛应用于肿瘤方面的研究，与测序技术、PCR技术、cDNA微阵列技术、基因表达系列分析（SAGE）生物标记、定量蛋白质组等技术相结合，现已应用于肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、结肠癌、淋巴瘤、卵巢癌等的研究[11]。科研人员可以借用LCM精确分离捕获单细胞的优势对病况的分子谱进行分析，然后进一步的探究特定细胞群的遗传学、解剖学特征以及相应的功能。利用LCM我们可以整理正常细胞群、癌前细胞群和恶性细胞群之间的遗传、表观遗传学和基因表达差异，将肿瘤易感基因筛选出来，然后对肿瘤的发生以及发展进行分析，最后揭示它的发病机制、发展进程等，它对特定细胞群的选择性有望大大改善许多人类疾病的诊断和管理[10,11]。

3.1.1 LCM结合肿瘤的基因组学分析

20世纪90年代中期发展起来的LCM技术能够快速精确地从复杂组织中分离出单细胞或细胞群，利用这些优点可以捕获肿瘤细胞，它不会改变组织的特性，获得单一的肿瘤细胞基因组进行突变检测，基本消除了其他组分对癌细胞基因组的污染，排除了因选用样品引起的误差[12]。

杨祎[13]等利用激光显微切割技术分离了一些胃癌细胞，结合全基因组放大技术将其基因组放大，然后进行与胃癌有关的前列腺干细胞抗原基因（PSCA）rs2976392与rs2294008位点的单核苷酸多态性（SNP）分析。研究结果表明，全基因组放大技术保真性较高，分离出来的癌细胞中SNP的灵敏度和准确性大大的提高。

在2010年，Navin等通过他们称为 SPP（Sector-Ploidy-Profiling）的方法[14]，进行乳腺癌肿瘤细胞起源的研究。首先利用显微切割获取少量乳腺癌组织，再通过流式分选（Ploidy），进而通过比较基因组杂交技术（comparative genomic hybridization，CGH）分析基因组染色体扩增/缺失。结果发现有些是单克隆起源，而有些是多克隆起源的[15]。

俞莎莎[16]等通过全外显子测序来对某一肺癌患者的肿瘤和相应癌旁组织测序，然后利用COSMIC肿瘤数据库比较分析，找出可能的致病基因，并通过LCM提取5个不同部位的肿瘤细胞，初步探索其起源和演化，再利用巢式PCR扩增技术以及一代测序来验证基因分型。结果发现这例肺癌患者的7个高频突变基因分别是LPHN2、TP53、MYH2、TGM2、C10orf137、MS4A3 和 EP300，这些基因它们的基因分型不同。

3.1.2 LCM结合肿瘤的转录组学分析

RNA为基因表达产物，RNA水平的分析包括RT-PCR、cDNA微阵列等其他技术，这些分析过程需要较完整的RNA作为实验材料，利用LCM获取单一细胞，RNA分析能够更准确地了解基因表达情况。

从复杂的生物组织（如大脑）获得高质量的RNA是建立高保真细胞类型特异性转录组所必需的。通常，将基因标记技术与LCM结合起来就足够了，但对RNA降解和产量有限的担忧使许多测序研究产生了疑问。Farris Shannon[17]描述了从新鲜冷冻组织激光捕获高质量的RNA，然后为其确定合适的RNA-Seq文库生成方法，结果发现，当消化时间和温度最小化时，可以从薄层组织的激光捕获材料中分离出足够浓度的高质量RNA（RNA完整性指数，RIN＞9）。而且发现通过cDNA文库生成保留核糖体RNA的文库生成方法所需的PCR周期更少，从而最大程度地减少了所得文库中的偏倚。最后测序前rRNA的终末消耗会增加靶RNA的含量，从而增加读取深度和基因检测水平，同时降低测序成本。

吴莹[18]等利用LCM分离出61例不同个体结肠组织中的上皮细胞（24例正常组织，13例腺瘤，24例癌组织），与microRNA芯片技术相互结合检测在肿瘤细胞中特异表达的microRNA，分析相同组织microRNA 表达情况的相关系数，结果表明了LCM与Agilent microRNA 芯片技术相结合的实验稳定性。最后，采用定量RT-PCR、LCM、Agilent microRNA芯片技术结合验证了LCM+Agilent microRNA 芯片实验的灵敏性以及稳定性，在科研、临床诊断方面将有很大的应用价值。

Xue Ruidong[19]对133种合并的肝细胞和肝内胆管癌（cHCC-ICC）病例进行了基因组和转录组测序，包括单独、合并和混合的亚型，结合LCM、癌细胞分数分析和单核测序技术，发现cHCC-ICCs有大量的Nestin表达，这说明Nestin可以作为诊断肝内胆管癌的生物标记，也为肝内胆管癌提供了重要的诊断意见。

3.1.3 LCM结合肿瘤的蛋白质组学分析

随着人类基因组计划的实施和快速发展，生物学研究已经进入后基因组的水平，即蛋白质组学（Proteomics），它已经成为研究的核心内容之一。对临床病例研究，找到标志物是蛋白质组学分析的一个重要方向。

徐学清[20]等利用LCM和质谱方法联合研究乳腺癌上皮细胞和间质间蛋白表达的差异，结果共检测到431种蛋白，这些差异表达蛋白可以是疾病的筛选、诊断和预后判断的蛋白标志。李国庆[21]等采用LCM和同位素标记联合的方法捕获结肠组织（正常的和患有结肠癌的），对蛋白进行相对和绝对定量（iTRAQ），接着利用强阳离子柱分离和反相液质联用（2D-LC-MS/MS）对差异表达的蛋白进行鉴定，最后采用Western blotting及免疫组织化学技术（IHC）证实定量蛋白质组学结果的可靠性。研究表明，蛋白质的差异表达与结肠癌的发生有关系，而且有可能会作为是否发生结肠癌的分子标志物，为结肠癌的诊断提供新线索。

3.2 在其他疾病诊断方面的应用

LCM成功解决了细胞之间异质性问题，除了被广泛应用于多种肿瘤病理学研究外，在其他疾病的病理诊断中发挥着很大作用，并表现出良好的应用价值。

3.2.1 LCM应用于阿尔茨海默病的诊断

阿尔茨海默病（AD）是一种神经系统退行性疾病，通常该病多发于70岁以上的人群并有年轻化发展的趋势。随着科技的发展，LCM技术逐渐在该疾病的诊断方面发挥着重要的作用。

Drummond Eleanor[22]等使用局部蛋白质组学分析快速进展性阿尔茨海默氏病（rpAD）和典型的散发性阿尔茨海默病（sAD）中淀粉样蛋白斑块中的蛋白质差异，对从rpAD和sAD患者显微切割的淀粉样蛋白斑进行了无标记的定量LC-MS/MS并定量了蛋白质表达差异，发现快速进展性阿尔茨海默氏病斑块中蛋白质的累积差异，表明它可能是阿尔茨海默氏病的一种新型亚型。

3.2.2 LCM应用于感染性疾病的诊断

Zhou Ya Bin[23]等首次应用LCM和PCR相结合来确认长支原体感染。由LCM获得的细胞DNA的测序结果表明与PCR测序结果相同。尽管存在潜在的弊端，需要收集大量单一细胞耗时久，可能会影响后续实验，但基于分子生物学技术的LCM技术还是一种用于判断“真菌污染物”感染的很有前途的诊断工具。

3.2.3 LCM应用于缺血性中风疾病的诊断

García-Berrocoso Teresa[24]等获得了缺血性中风患者的死后脑切片，通过激光显微切割分离梗塞（IC）和对侧（CL）区域的神经元和血脑屏障结构（BBB）作为对照研究，并使用无标记定量分析。结果表明对人脑缺血后神经元和BBB的定量蛋白质组的分析有助于增加对缺血性中风病理学分子机制的了解，并突出显示可能代表脑缺血或治疗靶点生物标志物的新蛋白质。

3.3 在植物学方面的应用

1992年，激光显微切割技术开始用于植物样品的制备[25]，近年来，利用该技术在相关植物的基因组、转录组和蛋白质组的分析发展较迅速[26-28]。然而，植物细胞与哺乳动物细胞的质地相反，大多数植物组织的细胞组织具有坚硬的含纤维素的细胞壁，较大的液泡和空隙，因此使组织的制备和大分子（例如DNA）的提取变得复杂。

3.3.1 LCM结合植物基因组学的分析

植物的生长和发育是由胚细胞不断进行特异分化，形成不同的组织和器官，若要对某一特别的细胞类群进行基因组学分析是比较困难的。如今可以利用LCM技术获取某一特定的细胞类群，然后进行相关的分析，同时也成功的解决了分离异质细胞的问题。

Rossi Marika[29]等应用LCM技术分析拟南芥特定组织中的细胞支原体基因表达谱。他们的研究表明LCM与拟南芥的结合使用为探索植物的生物学、分子和生物信息学以及阐明这些重要植物病原体感染机制的关键途径开辟了道路。

3.3.2 关于转录组学和蛋白组学的分析

目前转录组学和蛋白质组学都在植物各方面研究中大量应用。通常转录组水平的分析有RTPCR、cDNA微阵列等技术，该研究过程可利用LCM技术获取单一且较完整的细胞，这有助于准确地了解基因表达情况，然后在进行后基因组水平的研究。 Canas Rafael A[30]等从1个月大的海岸松（Pinus pinaster）幼苗中分离了14种不同的组织，并分析了它们的转录组获得的不同海岸松组织中基因表达的分布情况，明确了组织基因表达与功能之间的关系。该转录组图谱是针叶树功能基因组学研究的宝贵资源。

Yingxin Zhong[31]等对开花后19天的小麦用激光显微切割将糊粉、外胚乳、中胚乳、内胚乳和转移细胞从中分离出来，然后用qRT-PCR和LC-MS分别测定不同组织基因表达和蛋白质的氨基酸水平。他们的实验结果为深入了解胚乳中的蛋白质合成和氨基酸转运途径提供了科学依据，并提出了提高优质珍珠白小麦品质的可行性途径的建议。

研究富含多酚或多糖的树木的miRNA或基因的表达通常具有挑战性。对此，Swati, Verma[32]等利用激光捕获显微切割的方法，对木本苹果芽分生组织进行有效分离，并获得miRNA和基因的表达分析数据。他们实验证实，从LCM分离的苹果芽分生组织中的RNA含有miRNA，并且其数量和质量均良好，足以用于下游表达分析。

Sui Xiaolei[33]等利用显微镜，荧光染料迁移分析，显微计算机断层扫描，激光捕获显微切割和RNA测序（RNA-Seq）等技术相组合来研究内部韧皮部（IP）和外部韧皮部（EP）在黄瓜果实维管束（VB）中的功能。RNA-Seq数据表明，与分化/发育、激素转运、RNA或蛋白质修饰/加工/运输以及氮化合物代谢和运输有关的基因转录优先。这些发现为黄瓜果实维管组织中特定细胞转录组的分析提供了科学依据。

4 展望

LCM是近来快速发展起来的一个新兴技术，其最大的优点在于快速、准确，它也成功地解决了分离异质性细胞的问题。与其他研究技术联合，推进了特异性细胞基因组、转录组和蛋白质组等相关的研究，并显示出了良好的应用前景。如今，LCM技术被广泛应用与各个领域，但对于常规染色的组织切片，由于很难分辨组织结构，尤其对于一些组织结构较复杂的样本想要准确分离出目标细胞也比较困难。随着科技的发展，研究人员通过免疫组化方法，成功的解决了目标细胞难以分离出来的问题。 就目前LCM技术的应用来看，随着对实验精细度不断提高，也要求LCM技术能更进一步完善，例如切割微小组织时样品需求量大，需要大量的时间去捕获，以致影响下游实验研究，比如样品RNA提取的质量。

此外，对于激光显微切割技术与弹射（PALM）技术结合而言，操作过程中目标细胞捕获相对困难，出现弹射方向偏移等问题，无法准确地将目标细胞弹射到收集盖中，因此后续可以开发相应的智能操作系统，根据目标细胞的参数直接快速切割，准确捕获。还有在激光切割过程中由于切片厚度太厚，导致目标细胞无法切割分离出来，建议可以开发设计更大的能量范围，供给研究人员进行选择，快速捕获加快实验进程，而不只是仅仅局限于低能切割。相信随着科学技术的发展，技术体系逐渐完善以及更多高效试剂盒的研发，LCM技术势被应用于更多的生物医学等研究领域。