mTOR相关信号通路介导的自噬对肝损伤的调控作用

黄 倩， 李京涛， 刘永刚， 魏海梁， 闫曙光， 郭英君， 常占杰

1 陕西中医药大学 a.第一临床医学院； b.基础医学院， 陕西 咸阳 712406； 2 陕西中医药大学附属医院a.肝病一科； b.普外一科， 陕西 咸阳 712406； 3 宁夏回族自治区人民医院 感染疾病科， 银川 750001

郭英君，电子信箱：510410652@qq.com

肝脏是人体最大的实性脏器，在营养物质的储存代谢、新分子的合成和有毒化学物质转化等多种生理过程中起着关键作用[1]。肝炎病毒、某些药物和酒精等是引起肝损伤的常见因素，严重者出现肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。自噬是一个溶酶体降解的过程，调节细胞器和蛋白质的稳态。一方面，自噬调节肝脏生理和平衡肝脏代谢，通过消除肝脏疾病中出现的受损细胞器和蛋白质，保护肝细胞免受损伤和死亡；另一方面，自噬促进肝损伤的进一步恶化(如过度自噬可导致肝细胞自噬性死亡；增加肝星状细胞自噬可促进其活化，加重肝纤维化)[2]。因此，自噬的正确调节对肝损伤的治疗意义毋庸置疑。研究[3]发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种保守的代谢传感器，其作用靶点能有效调节自噬，mTOR通过调节自噬相关蛋白(autophagy-related proteins，ATG)和溶酶体生物合成，在自噬过程中起着负调节作用。mTOR受多种不同的上游信号通路的影响，这些信号通路可以通过调节mTOR相应地抑制或增强自噬水平。本文主要论述磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)上游途径介导的mTOR自噬在不同肝损伤中的作用，以期通过调节自噬为肝损伤的治疗提供新的靶点。

1 自噬的分类及过程

自噬是细胞通过自身降解和代谢产生的一种“自我进食”的过程,分为非选择性自噬和选择性自噬。非选择性自噬用于饥饿条件下的体细胞浆周转，而选择性自噬主要针对受损或过量的细胞器，包括受损的线粒体、不需要的过氧化物酶体、过量的核糖体和脂滴，以及侵袭性微生物[4]。根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同，自噬可分为巨自噬、微自噬和伴侣介导自噬。通常所说的自噬是指巨自噬(以下简称自噬)。mTOR和AMPK是自噬的主要调控因子， mTOR为抑制因子，AMPK为激活因子。自噬的不同步骤受到对应的ATG的调控。自噬的过程分为5个连续的步骤：分隔膜的形成、分隔膜的延伸、自噬体的形成、自噬溶酶体的形成、自噬溶酶体的降解。正常条件下，细胞自噬水平普遍较低，当受到缺氧、氧化应激、蛋白质聚集、内质网应激等刺激时，会进一步诱导自噬。自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，当自噬体与溶酶体融合时，位于自噬体内膜上的微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule-associatedprotein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)在自溶体内降解，而位于自溶体细胞质面上的LC3-Ⅱ被ATG4破坏并再循环。降解后生成的氨基酸、脂类和碳水化合物通过转运蛋白和渗透酶到达细胞质，实现了细胞内物质的循环利用[5]。

2 mTOR概述

2.1 mTOR结构和对自噬的调节 mTOR是PI3K相关激酶家族中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由2549个氨基酸组成，包含多个功能域和调节域。mTOR包括两个不同的信号复合物：mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)。mTORC1是细胞分解代谢和自噬的关键调节因子，对自噬具有负性调节作用，但其调节自噬的机制复杂，自噬相关蛋白的调节和溶酶体的生物合成是整个过程的关键。mTORC1至少以4种方式[6-8]调节自噬。其一，mTORC1在Ser758处磷酸化unc-51样自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)，防止ULK1和AMPK之间的相互作用，从而抑制ULK1活性。AMPK是调节自噬所必需的，在葡萄糖缺乏期间，AMPK在Ser317/Ser777处磷酸化ULK1并将其激活。其二，mTORC1也直接磷酸化ATG13以抑制ULK复合物的活性，而ATG13中的mTORC1磷酸化位点仍有待确定。mTORC1通过直接磷酸化自噬/苄氯素1调节因子1抑制自噬，其促进Beclin-1与脂质激酶VPS34的相互作用，从而促进自噬体的成核。其三，mTORC1通过在多个位点(Ser3、Ser223、Thr233、Ser383和Ser440)直接磷酸化Ⅲ类PI3K复合物中的ATG14来抑制自噬。ATG14的磷酸化抑制相关激酶VPS34产生磷脂酰肌醇-3-磷酸，帮助自噬体的形成。其四，mTORC1通过调节溶酶体形成所需基因的转录间接抑制自噬。转录因子EB(transcription factor EB，TFEB)是溶酶体发生和自噬基因的主要转录调节因子。TFEB促进编码溶酶体发生和自噬所需蛋白质的基因转录，从而间接激活自噬。mTORC1直接磷酸化TFEB的Ser142和Ser211位点，将其保留在细胞质中以抑制自噬[9]。研究[10]表明mTORC2可能通过激活mTORC1间接抑制自噬，mTORC2可以磷酸化疏水基序位点Ser473处的AKT，激活AKT/mTORC1信号轴。但mTORC2能否直接调节自噬还有待进一步研究。

2.2 mTOR在肝脏代谢和肝病中的作用 肝脏作为人体重要的代谢器官，在调节酮类、脂质代谢、血糖和胰岛素稳态方面发挥着关键作用，mTOR在这些过程中扮演着重要角色[11]。肝脏在人体禁食后会调动多种功能来维持系统平衡，包括增加酮体的产生，为周围组织提供能量。Sengupta等[12]发现mTORC1在肝特异性TSC1缺失小鼠的肝脏中被激活，导致禁食期间酮体生成和生酮基因表达明显缺陷，提示mTORC1能抑制禁食小鼠的酮生成。研究[13]发现转录因子SREBP的激活促进脂肪生成，在肝脏中，mTORC1通过两条独立的途径上调SREBP的表达。一种是S6K1依赖性方式，介导SREBP-1的成熟。另一种在营养素和生长因子的作用下，mTORC1直接磷酸化mTORC1底物磷脂酸磷酸酶lipin-1(SREBP-1活性的负调节因子)，防止脂质移位进入细胞核，从而使SREBP转录活跃，促进脂质合成[14]。在L-TSC1-KO小鼠中，mTORC1信号的慢性激活对胰岛素受体底物1产生强烈的抑制性反馈，导致AKT信号减少，葡萄糖不耐受。mTORC2也能维持脂质和葡萄糖平衡[15]，肝脏特异性基因敲除物Ricto(mTORC2的核心成分)小鼠表现出低血脂和高血糖[16]。此外，mTOR介导的自噬能减轻肝损伤。在肝缺血再灌注损伤中，mTOR介导的肝细胞自噬激活可促进肝细胞存活，抑制肝细胞凋亡，从而修复肝缺血再灌注损伤[17]。在肝癌中，抑制mTOR介导的肝癌细胞保护性自噬可以加速肝癌细胞的死亡，缓解肝癌的恶性发展[18]。

3 自噬通过靶向PI3K/AKT/mTOR途径对肝损伤的影响

自噬的失调可以导致多种肝脏疾病，正确调节自噬是治疗肝损伤的关键。mTOR的主要靶点是调节自噬的核心中枢，通过调节mTOR介导的自噬，有望找到基于自噬治疗人类肝病的新靶点。

PI3K/AKT信号通路参与细胞增殖、凋亡、自噬等多种功能的调节。PI3K是细胞内脂质激酶家族的成员，磷酸化30个磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇的羟基。根据结构、功能和底物的不同，PI3K可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4类，Ⅰ类PI3K在调节细胞生长和存活方面起关键作用[19]，故主要讨论Ⅰ类PI3K。Ⅰ类PI3K分为ⅠA类PI3K和ⅠB类PI3K。ⅠA类PI3K是由调节亚基 P85和催化亚基 P110构成的异二聚体，由受体酪氨酸激酶激活。ⅠB类PI3K被G蛋白偶联受体激活，由催化亚单位p110γ和调节亚单位p101或其同系物p84和p87PIKAP(87 kD的PI3Kγ衔接蛋白)的异二聚体组成。当细胞受到刺激时，ⅠB类PI3K的调节亚基直接与三聚体G蛋白的Gβγ亚基相互作用，激活ⅠB类PI3K的催化亚基[20-21]。AKT属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，由AKT1、AKT2和AKT3三个亚单位组成。AKT2在肝细胞中的表达最多，占肝脏AKT的85%。AKT是PI3K的一个关键下游靶点，通过磷酸化参与细胞生存、增殖和代谢而发挥多种下游效应[22]。AKT的Ser473和Thr308的氨基酸残基分别被mTORC2复合物和蛋白PDK1磷酸化以完成激活。PI3K/AKT信号通路在肝损伤中起关键作用。研究[23]表明一氧化碳预处理可通过诱导肝内PI3K/AKT通路的激活，抑制AKT下游底物GSK3β的活性，从而降低炎症因子的表达，增强抗炎能力，降低肝细胞损伤程度。低温预处理可以通过激活PI3K/AKT/FoxO3a途径抑制细胞凋亡和炎症损伤，提供保护肝脏的有效手段[24]。除了GSK3和FoxO转录因子外，mTOR也是AKT的关键下游信号节点。AKT激活mTORC1的主要机制是通过直接磷酸化和抑制TSC2(mTORC1的有效抑制剂)，从而间接激活了mTORC1[25]。此外，AKT还可以通过磷酸化和抑制PRAS40(一种负调控复合物激酶活性的mTORC1成分)直接激活mTORC1以抑制自噬[26]。Mammucari等[27]发现饥饿小鼠骨骼肌中mTOR2的抑制导致自噬的诱导，该自噬由AKT负调控的下游靶向FoxO3转录因子介导，提示mTORC2也可能负性调节自噬。如上所述，PI3K/AKT信号通路是mTOR的上游调控因子，通过激活PI3K/AKT/mTOR介导的自噬能有效改善或逆转肝损伤。

3.1 慢性乙型肝炎 HBV是一种带有圆环的小DNA病毒，如果抑制不佳，可通过慢性感染肝细胞而出现“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲[28]。据报道[29]，全世界约有3.5亿人感染HBV，因此HBV影响宿主细胞促进病毒复制的机制一直是研究的热点。新近研究[30]表明自噬与HBV的复制有关，microRNA-99家族成员可通过直接靶向其mRNAs降低胰岛素样生长因子1受体(recombinant insulin like growth factor 1 receptor，IGF-1R)、AKT和mTOR的总水平及磷酸化水平，然后进行ULK1去磷酸化，导致自噬体的形成，从而诱导自噬促进HBV的复制，自噬促进HBV的复制是microRNA-99家族通过IGF-1R/PI3K/ AKT/mTOR/ULK1信号通路诱导的。Wang等[31]发现HBx转染HepG-2细胞(一种广泛应用的人肝癌细胞)后，通过PI3K/AKT/mTOR途径显著提高了其自噬水平，表明增加肿瘤细胞的自噬可以提高其抗应激能力，促进肿瘤细胞的存活。因此，PI3K/AKT/mTOR介导的自噬可能是HBV感染后肝癌发生的重要机制，抑制PI3K/AKT/mTOR介导的自噬可能是治疗慢性HBV感染的新靶点。

3.2 肝纤维化 PI3K/Akt/mTOR是肝纤维化形成过程中重要的信号通路之一，该通路通过调控肝星状细胞(HSC)的增殖和凋亡在肝纤维化的形成过程中发挥着重要作用。肝纤维化是慢性肝损伤的重要病理生理后果，其主要特点是细胞外基质(ECM)不断积累，瘢痕组织的形成导致肝实质破坏。纤维化最终会导致器官衰竭，预防纤维化疾病取决于清除过多ECM的能力，而HSC是ECM的主要来源，因此，HSC的激活是肝纤维化发展的关键因素[32]。自噬在肝纤维化中起着双重作用。一方面，细胞自噬可以通过激活HSC进而促进肝纤维化的发生；另一方面，细胞自噬通过保护肝细胞减少ECM的产生，进而通过有效降解异常突变蛋白表达水平有效减缓肝纤维化进展[33]。HSC中自噬的增加可以通过降解脂滴来激活HSC，从而提供能量[34]。例如，研究[35]发现IGFBPrP1通过促进PI3K/AKT/mTOR信号途径介导的自噬而促进HSC的激活。但另一项研究[36]通过用不同浓度的甲基螺旋体(methyl helicterate,MH)处理HSC-T6细胞，发现MH抑制HSC的活化，显著提高HSC的自噬水平，当使用自噬抑制剂3-MA或ATG5敲除来抑制HSC-T6细胞的自噬时，MH抑制HSC-T6细胞活化的能力减弱。mTOR诱导HSC-T6细胞自噬可增加HSC-T6细胞凋亡，提示HSC自噬的增加抑制了HSC的活化，PI3K/AKT/mTOR通路是MH诱导HSC自噬的主要机制。Lee等[37]发现天然化合物芦丁和姜黄素通过调节PI3K/AKT/mTOR途径刺激脂肪酸诱导的NHSC自噬(非化学诱导的HSC)，NHSC的活化受到抑制。李硕熙等[38]研究发现芪参汤通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化，进而抑制肝组织中胶原沉积，减缓纤维化进展。以上结果提示PI3K/AKT/mTOR介导的自噬在逆转肝纤维化中的重要作用，但其双向调节作用的原因尚不清楚，可能是由于PI3K/AKT/mTOR通路在HSC活化中的特殊作用，或是HSC自噬活化的程度不同：HSC自噬的适度活化可以为HSC的活化提供能量，HSC自噬的过度活化可能引起HSC自噬细胞死亡，从而抑制HSC的活化。

3.3 肝癌 肝癌是一种高度恶性和致死率高的肿瘤。自噬和PI3K/AKT/mTOR途径在肿瘤发生和治疗中起着重要的调控作用，是许多抗癌药物的治疗靶点。自噬在肝癌发展的不同阶段起着双重作用。一方面，自噬可以通过去除正常细胞中受损的细胞器和特定蛋白质来防止肿瘤转化，改善癌细胞的炎症反应和基因组不稳定性，发挥抑癌作用。另一方面，适当的自噬可以通过满足肿瘤细胞的代谢需求促进肿瘤细胞的生存和恶性行为，加剧肿瘤的恶化[39]。因此，平衡自噬活性在癌症治疗中的意义非凡。目前，自噬抑制剂氯喹和羟基氯喹或自噬诱导剂雷帕霉素及其同系物在肝癌发展的不同阶段都能发挥相应的自噬调节作用[40]。有研究[32]报道，许多癌细胞异常激活AKT和PI3K，导致mTOR激活，mTOR通过磷酸化下游p70S6K和4EBP1来激活蛋白质合成，调节癌细胞增殖。一些中药如姜黄素和青藤碱通过阻断PI3K/AKT/mTOR途径发挥重要的抗癌作用[41]。但是当PI3K/AKT/mTOR途径被抑制时，其下游的关键自噬被激活，成熟癌细胞自噬激活促进恶性行为，与PI3K/AKT/mTOR途径对癌细胞的抑制作用相矛盾，提示自噬抑制剂与PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂的联合应用在肿瘤治疗中具有重要意义。例如，芹菜素可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR途径抑制肝癌细胞增殖并诱导自噬，Yang等[42]发现自噬抑制剂与芹菜素联合应用更为有效。但Ye等[43]发现通过抑制PI3K/AKT/mTOR途径激活肝癌细胞自噬，能有效诱导肝癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖及肿瘤的侵袭和迁移，结果表明自噬的激活并不促进肝癌细胞的恶性行为，其主要原因可能是通过PI3K/AKT/mTOR途径过度激活肝癌细胞自噬，从而导致肝癌细胞自噬性死亡(又称程序性细胞死亡Ⅱ型)。自噬在肿瘤发生中的作用一直存在争议，故而今后的研究应更多地关注PI3K/AKT/mTOR介导的自噬在肝癌不同发展阶段的作用，为PI3K/AKT/mTOR介导的自噬治疗肝癌提供更可靠的依据。

3.4 非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 非酒精性脂肪肝(NAFLD)是世界上最常见的慢性肝病，随着人们生活水平的提高，其发病率逐年攀升。NAFLD包括从单纯性脂肪变性到NASH、肝纤维化、肝硬化等一系列组织学异常改变[44-45]。NASH是包括胰岛素抵抗、氧化应激、自噬受损、脂肪毒性和肠源性脂多糖(LPS)等多种因素联合作用的结果。自噬通量受损，导致p62和泛素化蛋白聚集是NASH的共同特征。肝细胞中p62包涵体的形成是区分NASH和单纯性脂肪肝的一个重要标志，是预测肝癌发生的重要指标[46-47]。研究[48]发现东莨菪碱能改善甲硫氨酸胆碱缺乏诱导的NASH小鼠肝脏自噬通量的损伤和p62的积累。东莨菪碱通过LPS激活的RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)来阻断PI3K/AKT/mTOR通路，增强巨噬细胞(而非肝细胞)的自噬功能，改善小鼠自噬和NASH相关的炎症反应，减少p62和LC3的积累。在RAW264.7细胞中，东莨菪碱降低了LPS诱导的自噬体和自噬底物的积累、活性氧的产生和炎症反应，加速LPS诱导的RAW264.7细胞自溶体的形成,改善NASH的几个关键特征(包括血清ALT和AST水平升高、肝组织学改变和促炎症基因的表达)，且无明显副作用。研究[49]显示AKT激活剂SC79能激活mTOR并抑制自噬，但对炎症没有显著影响，这可能是PI3K/AKT信号通路多重作用的结果。综上在LPS诱导的RAW264.7细胞中，东莨菪碱通过增加自熔体形成和负性调节PI3K/AKT/mTOR途径，加速自噬通量，促进自噬体降解，有望成为治疗NASH或与巨噬细胞自噬失调相关疾病的新型药物。

4 小结

在自噬调节肝损伤的过程中，mTOR相关上游途径PI3K/AKT介导的自噬参与了不同肝损伤的发展和转归，调控PI3K/AKT/mTOR信号通路介导自噬的相关研究与探索为防治肝脏疾病提供了一些新思路和途径，研究表明相关药物可以通过mTOR上游途径介导自噬治疗肝损伤，但药物对该途径的哪一部分的调节尚不清楚。因此，下一步的研究焦点应在探讨药物靶向PI3K/AKT/mTOR通路的具体机制上进行更深入研究。

作者贡献声明：黄倩负责阅读,分析文献，收集数据及撰写论文；闫曙光、魏海梁、郭英君负责修改论文；李京涛、刘永刚、常占杰负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。