IHH 信号转导与骨关节炎患者软骨代谢的研究进展

许肖 刘芳 刘绍灵

骨关节炎 ( osteoarthritis，OA ) 是关节软骨的局部损伤和丢失、异常重塑和磨损、局部炎症等一系列病理改变导致的退行性变[1]。关节软骨是覆盖于关节的表面的一层透明软骨，大约由 5% 软骨细胞和 95% 基质构成，基质以蛋白多糖凝胶以及 II 型胶原为主，有着承受机械负荷、润滑关节、防止磨损等重要作用[2]。成人关节软骨细胞处于一种“生长停滞状态”，当 OA 发生时，软骨细胞出现了一种类似于软骨内成骨的分化过程：软骨细胞肥大、终末分化、骨化、最后凋亡[3-4]，而在这一过程中，人体内出现了一系列胶原蛋白、非胶原蛋白以及细胞因子的改变或可作为用于临床诊治 OA 的相关生物标志物。

近年来发现的 OA 相关生物标志物多达 10余种[5]，其中非胶原蛋白类相关标志物的代表印度刺猬 ( Indian hedgehog，IHH ) 被证明与 OA 患者软骨代谢高度相关，可能在 OA 的发生发展过程中发挥重要作用。大量学者就IHH 与 OA 软骨的相关关系作了大量的动物及临床研究：Thompson 等[6]发现 IHH 蛋白在健康成人的软骨中几乎检测不到，但软骨损伤早期表达会增加；Zhang 等[7]也发现，在早期人关节软骨损伤中，IHH 基因表达上调；Mak等[8]通过上调出生后软骨中的刺猬 ( hedgehog，HH )信号发现软骨细胞肥大加速，进而导致关节软骨的减少，认为降低 Ihh 的活性具有软骨保护效应。Murakami 等[9]观察成年大鼠股骨骨折愈合过程时，发现 IHH 在软骨细胞和成骨细胞中表达，这提示 IHH 是软骨内骨化的调节因子。张洁靖[10]研究氟中毒大鼠软骨损害的影响时发现氟中毒主要通过 HH 信号通路损伤大鼠软骨细胞活性和凋亡，提示 IHH 参与软骨损伤的活动过程。王春理等[11]发现大鼠 OA 进展过程中 IHH 基因的表达量在早期有明显的升高阶段。孙一松等[12]通过离断前交叉韧带制造大鼠骨关节炎模型，发现 IHH 表达水平在骨关节炎的早期即明显升高，认为 IHH 在骨关节炎的退变过程中起重要作用。然而 IHH 与 OA 发生发展时软骨代谢的作用机制尚不明确，现就 IHH 与 OA 软骨代谢的相关关系作一综述。

一、IHH 概述

早在 20世纪 70年代，有学者在研究果蝇基因突变时就首次了发现 HH 基因[13]。之后在小鼠基因组中确定了脊椎动物的三个 HH 同源基因，编码 3种 HH 蛋白：音速刺猬 ( sonic hedgehog，SHH )，沙漠刺猬 ( desert hedgehog，DHH ) 以及 IHH。在小鼠胚胎中，SHH、DHH 和 IHH 在牙齿、头发、胡须、皱襞、肠道、膀胱、尿道、输精管、肺、施万和滋养细胞前体以及软骨中表达，表明 HH 信号在哺乳动物发育中的重要作用[14]。在软骨内成骨的过程中，IHH 主要由前肥大软骨细胞产生和分泌，并调节生长板软骨发育过程[15]。目前对于 IHH 调节软骨代谢的作用机制主要包括 HH-Gli 信号通路、IHH-PTHrP 信号轴、诱导骨髓间充质干细胞 ( bone marrow stromal cells，BMSCs )分化等。

二、HH-Gli 信号通路

HH-Gli 信号通路首先在果蝇中被发现，并在脊椎动物中得到了证实，通路包括 HH 蛋白、膜受体 Patched( Ptc ) 蛋白、膜受体 Smoothened ( Smo ) 蛋白、胶质细胞瘤转录因子 ( glioma-associated oncogene homologue，Gli ) 和下游靶基因[16]。Ptc 是 HH 的受体，本质是一种 12通道的跨膜糖蛋白，同时也是一种补体蛋白，包含两种同源基因Ptc1与 Ptc2，其主要表达于临近软骨膜区的细胞。在果蝇中，HH 通过抑制 Ptc 而发挥作用，在小鼠中也发现了 Ptc的同源基因，Ptc 在许多组织中是在分泌 SHH 与 IHH 的细胞附近转录，而这显示了 HH 信号的接收[17]。Smo 蛋白是一种 7通道的跨膜蛋白，属于 G 蛋白偶联受体超家族，也被提出是 HH 的受体。为了验证 Smo 的作用，Chen 等[18]通过纯合子细胞对 Smo 进行克隆进行验证实验，发现 HH的信号转导需要 Smo 蛋白。朱志坚等[19]将 Smo siRNA 序列经慢病毒载体转染到原代软骨细胞中，以抑制 Smo 的表达，并观察软骨细胞凋亡率，发现沉默 Smo 后细胞凋亡率显著上升，认为 Smo 具有保护软骨细胞免遭凋亡的作用。Taipale 等[20]研究发现 Ptc 和 Smo 在具有 HH 表达的细胞中没有明显的关联，游离的 Ptc 通过改变小分子的分布或浓度，从而间接抑制 Smo 的活性，并通过抑制状态的 Gli 阻遏下游基因的表达[21]，可以认为 Ptc 对 Hedgehog信号通路有负性调节作用 。当 IHH 信号出现时，其与 Ptc结合会使 Ptc 失活，从而使 Smo 的抑制被解除，并且激活Smo 使 Hedgehog 信号转到至胞内[22]，使活性的 Gli 进入细胞核，提高下游靶点的转录水平。Gli 是位于 HH-Gli 通路末端的锌指转录因子，脊椎动物中包含 Glil、Gli2与 Gli3三种因子，其中 Glil、Gli2是转录促进因子，Gli3是转录抑制因子[23]，直接调控着下游靶基因的转录。Gli1作为主要的转录因子，其水平的升高提示着 HH 信号通路的激活[24]。IHH 信号通过 HH-Gli 信号通路激活 Gli 后，可诱导转录因子 Runx2的表达，从而导致软骨细胞的肥大[25]。

细胞周期调控因子 D1( Cyclin D1) 是 HH-Gli 信号通路下游的靶基因之一，参与细胞周期 G1期的调控，位于11q13，cDNA 为 4.3Kb，被鉴定为原癌基因，在 G1期早期表达[26]。软骨细胞在特定的调控模式下进行增殖和分化，从而使长骨纵向生长，Yang 等[27]在研究了 Wnt 家族的两个成员 Wnt5a 和 Wnt5b 在长骨发育中的作用时，通过敲除小鼠的 IHH 或 Smo 基因，发现软骨细胞增殖率下降时伴随 cyclin Dl 的表达下调。Duman-Scheel 等[28]研究发现 HH 信号能促进果蝇发育过程中 cyclin E 和 cyclin D 的转录，这两种蛋白是细胞周期的主要调控因子，且 cyclin Dl 在软骨细胞增殖时高表达，在软骨细胞静止时低表达，这些充分提示 IHH 通过介导 cyclin Dl 的表达参与调控软骨细胞的增殖。

三、IHH-PTHrP 负反馈环

甲状旁腺素相关蛋白 ( parathyroid hormone related protein，PTHrP ) 是 1987年在患有恶性高钙血症的患者中首次发现的[29]，它是甲状旁腺素 ( PTH ) 家族的第 2个成员。PTHrP 分布范围广泛，在正常成人和胎儿体内许多组织器官如肺、心、肾、骨、脑、皮肤、乳腺、胰岛等均有所表达，发挥不同的生理作用。PTHrP 是自分泌或旁分泌的软骨分化调节剂，能够减少软骨细胞分化和阻止程序性细胞死亡。Vortkamp 等[30]在 1996年首次证实 IHH 和PTHrP 之间存在负反馈调节机制，并借此控制胎儿长骨发育过程中软骨细胞的增殖和分化过程。IHH 通过直接或间接的方式诱导关节周软骨膜内细胞合成 PTHrP，PTHrP 通过弥散作用与表达于增殖区和前肥大区软骨细胞表面的受体 PPR 结合，抑制该区域软骨细胞继续向肥大软骨细胞分化，通过将软骨细胞阻滞在增殖状态，减少前肥大软骨细胞的数量，从而减少 IHH 的表达量。IHH 和 PTHrP 之间的负反馈环对于依赖软骨内成骨方式的长骨发育过程是极其重要的[31]，PTHrP 在增值区软骨细胞中呈现高表达状态，故而 IHH 可在近距离直接调控软骨细胞的增殖和分化。van Donkelaar 等[32]应用一维理论模型研究 IHHPTHrP 反馈环在骨骺生长板中的作用，认为 IHH、PTHrP蛋白在调控软骨细胞增殖与分化中的作用是不等的，与IHH 相关的参数决定软骨细胞增殖，与 PTHrP 相关的参数决定软骨细胞肥大。而 Mak 等[8]对小鼠胚胎进行研究，观察到在软骨内骨骼发育过程中，在没有 PTHrP 的情况下，分别激活和灭活了 IHH 信号时发现体外用声刺猬 ( SHH )蛋白处理 PTHrP - / - 肢体外植体或在 PTHrP - / - 软骨中过度表达 IHH，可上调发育中软骨的 IHH 信号，HH 信号的负调节因子促进 PTHrP - / - 胚胎软骨细胞肥大。相反，当 HH 信号被环胺阻断或 HH 信号的正调节因子 Smo阻断时，PTHrP - / - 胚胎软骨细胞肥大延迟。此外，在继发性骨化过程中，出生后软骨中的 HH 信号上调会导致软骨细胞肥大的加速，进而导致关节软骨的减少，故降低IHH 的活性具有软骨保护效应，这也说明 IHH 信号在促进软骨细胞肥大中具有独立于 PTHrP 的作用[33]。

四、IHH 对 BMSCs 的诱导作用

BMSCs 是一类从骨髓中分离出来的具有强大增殖及分化能力的干细胞，在不同的诱导条件下可分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等多种组织细胞[34]。BMSCs 的增殖及成骨分化能力直接关系到骨形成活性。Foxc2属于转录因子 Forkhead 家族，参与间充质组织分化过程[35]。Lin 等[36]将 BMSCs 分别在基础培养基、柚皮苷基培养基、成骨诱导培养基，柚皮苷成骨诱导培养基，添入 IHH 抑制剂环巴胺的柚皮苷成骨诱导培养基中培养，通过 western blot 检测 IHH 蛋白水平，发现通过 IHH 信号通路能上调 Foxc2表达，诱导分化 BMSCs。Runx2是一种属于 Runt 同源域蛋白家族的转录因子，参与 MSCs 向成骨前体细胞分化的转录与调控，其也被称为成骨细胞特异性因子 2( OSF2)[37]。Oliveira 等[38]研究 HH激动剂 purmorphamine 在基因谱上对 HH 信号通路与成骨细胞分化的影响时发现，purmorphamine 激活 HH 通路并上调了 Runx2的表达，从而诱导 BMSCs 等分化。Liu 等[39]在体外构建了兔 IHH 基因的腺病毒质粒，并将其转染到兔 BMSCs 中，在模拟微重力环境下，IHH 转染组在分化的各个阶段表达高水平的软骨相关因子以及低水平的软骨肥大相关因子。因此认为 IHH 基因可诱导 BSMCs 分化，从而有效促进软骨生成，抑制软骨老化。

五、其它因子对 HH 信号的调控

转录激活因子-4( Atf4) 是一种含亮氨酸支链的转录因子，通过激活软骨细胞中的骨钙素 ( osteocalcin，Ocn )和 IHH 发挥作用。Atf4在软骨细胞和成骨细胞中对骨骼发育和骨形成的调控作用尚不清楚。Atf4最初被认为是一种具有成骨特异性的结核活性分子[40]，小鼠中缺失 Atf4会导致严重的骨质减少、成骨细胞终端分化受损、骨钙素表达降低及 I 型胶原合成减少[41]，随后的研究表明 Atf4也在软骨细胞中表达，通过转录激活 IHH 调控软骨细胞在骨骼发育过程中的增殖和分化[42]。

Kif7是驱动蛋白 4超家族的一员，与脑积水、肢端一胼胝体综合征等多种疾病相关，也参与了 HH-Gli 信号通路[43]。融合抑制因子 ( suppressor of fused，Sufu ) 常作为 HH 信号的负性调节因子[44]。Kif7通过 Sufu 促进 Gli 的活性，也可以通过非依赖 Sufu 抑制 Gli 的活性，Kif7与Sufu 的协同或拮抗作用通过影响 Gli 的活性而决定细胞的分化[45-46]。

六、IHH 与 OA 患者的软骨代谢

大量研究在观察动物 OA 模型或 OA 患者时，均可在血清、关节液或关节软骨中发现 IHH 表达的上调[6-7,11-12,47]。在正常的关节软骨中，IHH 信号通路是不活跃的。缺乏IHH 信号时，其下游的膜受体、Gli 等转录因子处于抑制状态。有学者认为，在 OA 软骨中机械负荷、损伤、炎症、遗传和衰老相关因素导致 IHH 表达升高，从而导致其下游的 Gli 等转录水平提高，进而出现 X 型胶原、基质金属蛋白酶 13( matrix metalloproteinase 13，MMP-13) 表达增加，最后导致软骨变性[48]。Lin 等[49]观察到在 OA 患者的软骨中 IHH 信号下游的 Gli、Ptc、Hhip mRNA 水平上调，而通过沉默小鼠的 Smo 基因可以有效减轻 OA 的严重程度。Zhou 等[50]通过删除小鼠软骨中的 IHH 基因，减弱了小鼠 KOA 的进展，认为阻断 IHH 基因可作为一种治疗方法来预防以及延缓软骨损伤的发生。Wei 等[51]发现 OA患者软骨和关节液中的 IHH mRNA 和蛋白水平提高的同时，X 型胶原和 MMP-13mRNA 和蛋白也存在上调。以上研究都揭示了 IHH 基因及其信号通路在 OA 患者关节软骨损伤中的病理作用。

IHH 表达水平的提高，是否加速了 OA 的病程进展目前尚存在争议。Sieker 等[52]将编码 IHH 的腺病毒载体颗粒植入兔膝软骨缺损处，观察到了较高质量的软骨修复；Ang 等[53]敲除小鼠软骨细胞中的 IHH 基因后发现，细胞生长被抑制而细胞凋亡增加。肢体长骨的常须依靠肢段软骨内成骨的方式，许多学者通过基因敲除后的小鼠观察到[33,54]：IHH 基因敲除的小鼠软骨细胞增殖下降，而且肢体短于空白对照组，这充分说明了 IHH 促进软骨细胞增殖的作用。

总之，IHH 作为一种与软骨高度相关的信号分子，在软骨退变期间表达活跃，IHH 的含量增加会导致软骨细胞向肥大细胞分化，也可能会促进软骨细胞的增殖修复。大量研究证实 IHH 与关节软骨的代谢高度相关，其主要调节机制包括 IHH-Gli 信号通路、IHH-PTHrP 负反馈环、对 BMSCs 的诱导作用等等，虽然目前对于其是否加速了OA 病程的进展仍存在争议，但不可否认 IHH 或可成为未来诊断 OA 的重要生物标志物以及治疗 OA 的潜在靶点。继续对 IHH 与关节软骨代谢的分子学机制作进一步研究，有望为治疗 OA 提供一种可供应用于临床的实验室指标，为广大 OA 患者的早期诊断、精准治疗带来福音。