细胞外囊泡与骨肉瘤

朱岩 樊根涛 曹莉莉 周光新

细胞外囊泡 ( extracellular vesicles，EVs ) 是由细胞分泌的脂质双层纳米囊泡，内含有核酸、蛋白质和脂质等维持正常细胞生理功能和介导细胞间通讯的因子[1]。EVs 异质性较大，不同的细胞分泌的 EVs 具有迥异的组成特点和功能[2]。EVs 从初始被认为细胞代谢废物到目前生物学功能逐渐受到重视，除了在细胞间信号通讯有重要作用外，还广泛参与细胞凋亡、肿瘤发展、血管生成和免疫反应等。几乎所有细胞在生理和病理情况下都分泌 EVs，并且在血液、尿液、唾液等体液中都可以发现 EVs[3-4]。EVs在肿瘤微环境中被大量观察到，不仅参加肿瘤的发生发展过程，也与多种骨疾病相关[5]。

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 是最常见的原发性恶性骨肿瘤，它多发于青少年和儿童，老年后达到第二发病高峰。虽然基于新辅助化疗联合手术治疗可以达到 60%～70% 的5年生存率，但是在复发性和转移性骨肉瘤患者中，原有治疗方式并不能取得有效的治疗效果。因此，需要基于骨肉瘤发展转移的机制，探索新的治疗方向[6]。近年来，大量外泌体相关的研究表明 EVs 在骨肉瘤及其肿瘤微环境中发挥重要作用，但是由于分离方式局限、囊泡大小不一，部分情况下外泌体和微泡难以严格区分。因此，笔者以EVs 来综述其在骨肉瘤生长、转移、耐药和治疗等方面的机制，探讨其在基础研究和临床应用方面的前景。

一、骨肉瘤细胞来源的 EVs 对肿瘤微环境的影响

1. 促进肿瘤血管生成：肿瘤血管生成参与骨肉瘤生长、进展和转移的过程，可以为瘤体提供成长必需的氧气和营养，并为肿瘤细胞进入循环系统，扩散至远处的器官提供逃逸途径[7]。在多发性骨髓瘤、结直肠癌、前列腺癌和肺癌等其它肿瘤中，已经充分认识到了肿瘤来源的 EVs在促血管生成中具有重要作用[8]。Jerez 等[9]在对骨肉瘤细胞系 EVs 内容物进行蛋白组学分析后发现存在高表达与血管生成相关的蛋白。Perut 等[10]同样发现骨肉瘤细胞分泌的 EVs 中高表达的蛋白如 serpin-E1、TIMP-1等和 miRNA如 miR-382-5p、miR-150-5p 以及 miR-125b-5p 等能够帮助肿瘤血管生成，且这种活性随肿瘤微环境酸度的增加而增强。此外，Raimondi 等[11]发现骨肉瘤分泌的 EVs 能刺激血管内皮细胞表达和分泌高水平的促血管生成因子VEGF、IL-6和 IL-8[11]。有学者对 236例骨肉瘤患者血清样本中 EVs 分析发现，与健康者相比，骨肉瘤患者血清EVs 中 miR-25-p 的含量明显增高，进一步的实验表明过表达的 miR-25-p 能促进人脐静脉内皮细胞功能[12]。随着骨肉瘤抗血管生长治疗的发展，针对 EVs 促血管形成机制可能是潜在的治疗靶点。

2. 激活破骨细胞：骨肉瘤是一种成骨肿瘤，但同时破骨细胞在促骨肉瘤侵袭和化疗耐药中具有重要的作用[13-14]。相应的，除分泌破骨细胞诱导因子外，骨肉瘤细胞分泌的 EVs 在改变骨肉瘤微环境中的骨重塑稳态中也表现出明显的促破骨细胞活性[11,13-16]。Rama 等[15]在骨肉瘤细胞分泌的 EVs 中鉴定出基质金属蛋白酶 MMP1和 MMP13、转化生长因子 TGF-β 和 RANKL 等促破骨细胞因子[15,17]。此外，Raimondi 等[11]在 EVs 中发现了与骨重塑相关的的 miR-148a-3p 和 miR-21-5p。高表达的miR-148a-3p 在体内骨骼稳态中通过激活 RANKL 信号通路促破骨细胞生成[17]。miR-21-5p 在破骨细胞前体中高度表达，能够下调 PDCD4( 程序性细胞死亡 4) 蛋白的表达水平，消除其对转录因子 c-Fos 的抑制作用。同时，RANKL 诱导 c-Fos 上调 miR-21-5p 的表达。因此，c-Fos /miR-21-5p / PDCD4形成正反馈环，促进 RANKL 诱导的破骨细胞生成[18-19]。这些研究表明，骨肉瘤细胞分泌的EVs 在骨肉瘤骨微环境中能通过激活破骨细胞来进一步促进肿瘤进展。

3. 诱导间充质干细胞促肿瘤：目前还未知骨肉瘤发生相关的特定驱动基因和起源细胞，但是目前研究表明间充质干细胞转化过程中的表观遗传可能是骨肉瘤进展过程中的早期事件[20]。处于肿瘤炎性微环境中的间充质干细胞通过分泌一系列细胞因子、炎性因子及趋化因子促进肿瘤进展[21]。作为细胞间通讯的重要载体，与上述激活破骨细胞的生物学特性相似，骨肉瘤细胞通过 EVs 诱导间充质干细胞成为促肿瘤进展的帮凶。Mannerström 等[22]发现骨肉瘤细胞来源的 EVs 内 LNE 1( 长散布核元件 1) 低甲基化后调控间充质干细胞的表观遗传，进而促进 MMP1、VEGF-A和 ICAM 1( 细胞间黏附分子 1) 的表达。骨肉瘤细胞衍生的 EVs 可以通过激活间充质干细胞的促肿瘤和促转移表型而一步促进自身的转移过程[23]。Baglio 等[24]发现在骨肉瘤小鼠模型中，骨肉瘤来源的 EVs 选择性地升高膜相关形式的 TGF-β，并激发间充质干细胞分泌 IL-6促使骨肉瘤小鼠荷瘤生长和转移形成[25-26]。上述研究均发现肿瘤微环境中间充质干细胞促进骨肉瘤细胞的发展，但是部分研究表明处理和改造后的间充质干细胞可以抑制骨肉瘤细胞的生长[25-27]。提示阻断 EVs 在骨肉瘤细胞和间充质干细胞中的通讯作用后，间充质干细胞可能成为骨肉瘤治疗新的方向。目前，骨肉瘤来源的 EVs 促进间充质干细胞促肿瘤的研究较少，其机制值得进一步探讨。

4. 促进免疫抑制和化疗耐药：近年来随着骨肉瘤肿瘤微环境中免疫细胞与肿瘤细胞互相作用的研究的深入，免疫治疗也成为骨肉瘤辅助治疗的潜在选择[28]。Clayton等[29]发现骨肉瘤细胞分泌 EVs 运载 TGF-β，抑制 IL-2诱导的淋巴细胞增殖，从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸，其抑制效率是可溶性 TGF-巴的上千倍。除此以外，他们还发现骨肉瘤细胞 EVs 内 TGF-除显著下调 CD8+T 细胞外、还可抑制 NK 细胞表面 NK 细胞受体 NKG2D 的表达，从而降低机体淋巴细胞的活化及对肿瘤细胞的免疫[30]。

在犬骨肉瘤模型中，Troyer 等[31]在来源于骨肉瘤的EVs 中发现对 T 细胞具有免疫调节作用的 TGF-β，AFP( 甲胎蛋白 ) 和 HSPs ( 热休克蛋白 )，这些蛋白可以抑制CD4+和 CD8+T 细胞的活化和增殖能力。PD-L1( 程序性死亡配体 1) 通路的激活可以帮助骨肉瘤细胞逃避免疫监视，目前研究证明了 PD-L1的过表达与骨肉瘤中转移风险的增加有关[32-33]。在转移性黑色素瘤的研究发现，转移后的黑色素瘤细胞释放携带 PD-L1的 EVs，可用于预测抑制 PD-1/ PD-L1治疗的效果[34]，在骨肉瘤中能否通过肿瘤细胞分泌的 EVs 中 PD-L1判断预后及免疫治疗效果值得进一步研究。

肿瘤细胞在化疗治疗后会对该药产生获得性耐药性，称为原药耐药 ( primary drug resistance，PDR )，同时其还会对结构和作用机制不同的其它抗肿瘤药物产生交叉耐药性，即多药耐药 ( multidrug resistance，MDR )。虽然新辅助化疗的应用使得骨肉瘤患者的 5年生存率由不足 20% 升至65%～70%，但是仍有约 30% 的患者化疗后进展恶化。基于新辅助化疗方案是骨肉瘤治疗中的重要部分，已有研究表明多药耐药导致晚期骨肉瘤预后不佳，成为临床上骨肉瘤治疗的主要障碍[35]。目前，众多临床前和临床数据表明黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和肾癌等实体肿瘤化疗后会分泌 EVs 至非耐药细胞，诱导多药耐药表型[36]，由此可见，EVs 在肿瘤多药耐药机制中发挥重要作用。EVs 在骨肉瘤耐药中同样起关键作用[33]。Torreggiani 等[37]发现产生多药耐药的骨肉瘤细胞可以分泌包裹耐药相关性 mRNA及其产物 P-糖蛋白的 EVs，诱导非耐药细胞系产生多药耐药表型，降低骨肉瘤细胞对阿霉素的敏感性[38]。由此可见，EVs 作为生物活性载体，其包裹的耐药相关的因子和非编码 RNA 有希望成预测治疗效果和预后的标志物，以及逆转耐药和克服进展期骨肉瘤的治疗靶点[38-39]。

二、肿瘤微环境内细胞来源 EVs 的功能

间充质干细胞和癌症相关成纤维细胞可以通过旁分泌和囊泡分泌促进肿瘤进展和化疗耐药[40]。Wang 等[41]发现包裹在癌症相关成纤维细胞分泌的 EVs 中的 miR-1228通过下调 SCA1( 干细胞抗原 1) 的表达来促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。另一项研究结果表明间充质干细胞来源的EVs 通过激活 Hedgehog 信号通路介导对骨肉瘤的促肿瘤作用[42]。Lin 等[43]发现间充质干细胞来源的 EVs 通过激活 PI3K / AKT 和 HIF-1a 信号通路支持缺氧条件下 U2OS骨肉瘤细胞系的生长[44]。除此以外，成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞和免疫细胞与骨肉瘤细胞共存，并参与骨肉瘤细胞的生长和存活。它们分泌 EVs 的能力已经在其它病理生理模型中得到证实[33,44-46]。进一步研究这些细胞分泌的 EVs 如何作用于骨肉瘤细胞，将有助于阐明肿瘤微环境中参与细胞通讯的新因素和新机制，并发现新的靶点和生物标记物。

三、EVs 作为骨肉瘤相关生物标志物

鉴于液体活检的无创性、可重复取材、持续监测等优点，液体检测成为恶性肿瘤的诊断和预后检测新的方向。EVs 广泛存在于血液、尿液和唾液等体液中，并具有稳定的膜结构，含有具有功能性的核酸、蛋白质、脂质和非编码 RNA 等，从而具有成为生物标志物的巨大潜力[47]。利用基因组学和蛋白质组学等高通量检测手段，明确体液中肿瘤相关 EVs 和正常人之间的差异表达和特异性因子，对于疾病的诊断及预后的评估具有良好的临床价值和意义[48]。Brady 等[49]对犬血清样本中 EVs 的蛋白组学鉴定发现 EVs 内蛋白有助于区分骨肉瘤犬、健康犬和创伤性骨折犬的模型。除此以外，其还在患者血清 EVs 中发现了蛋白 SerpinD1和 MHC III 类补体 C6可以预测患者分期。Xu等[50]通过对化疗反应不同的患者血清 EVs 内 miRNA 对比发现，患者血清 EVs 内 miRNA 可能成为骨肉瘤患者化疗敏感性相关标志物。Bao 等[51]发现与骨肉瘤未转移的患者血清中 EVs 相比，发生骨肉瘤转移的患者血清中 EVs 中RNA 测序表明肿瘤突变负荷增加，可能成为预测骨肉瘤进展潜在的标志。目前，瑞金医院的一项评估骨肉瘤肺转移结节中循环外泌体 RNA 作用的临床试验 ( NCT03108677)正在进行中。

总之，骨肉瘤微环境中骨肉瘤细胞、间充质干细胞、免疫细胞、成纤维细胞、破骨细胞、成骨细胞和内皮细胞等共存并相互联系，EVs 在其细胞间通讯具有重要作用。一方面，骨肉瘤细胞分泌 EVs 到达受体细胞后促进肿瘤支持特性。另一方面，来源于肿瘤微环境细胞的 EVs 能够帮助肿瘤的生长和迁移。具有源头细胞的细胞膜特定组分和特异性包裹物的 EVs 具有成为诊断及预后标志物的巨大潜力。EVs 在骨肉瘤中具有上述多种功能，为发现新的治疗靶点和新的诊断分析提供了新的思路。日后，EVs 纯化和表征方面的技术进步有望更好的帮助 EVs 的检测和其生物特性研究，其在骨肉瘤临床应用前景更加广阔。