环状RNA在心血管疾病临床诊断和预警中的研究进展

吕梦伟, 章 兴 综述, 张杨杨，4 审校

(1. 南京医科大学上海东方临床医学院，南京 210029； 2. 同济大学心律失常教育部重点实验室，上海 200120； 3. 南京医科大学儿科学院，南京 211166； 4. 同济大学附属东方医院心脏大血管外科，上海 200120)

人类基因组只有部分DNA用于编码蛋白质，其余大部分转录成各类RNA最终并不被翻译成蛋白质，这些RNA称为非编码RNA[1]。部分非编码RNA参与基因转录后调控、剪切和修饰等，在生命活动中发挥重要的作用。环状RNA(circularRNA，circRNA)是一类双链闭合非编码RNA，无5′帽子结构及3′poly A尾，长度在几百到几千个核苷酸不等，不受RNA外切酶降解，稳定且广泛地存在于真核生物，具有进化保守性[2]。circRNA在许多疾病中起着重要的调控作用，如神经系统疾病、心血管疾病、糖尿病和肿瘤等[3]。本文就circRNA在心血管疾病临床诊断和预警方面的应用研究现状进行综述。

circRNA主要来自于外显子，和一般的RNA剪接模式不同。这种结构上的差异体现在3′端和5′端通过环化的方式结合在一起[4]。目前主要有3种环化的方式。(1) 内含子配对驱动的环化： 以内含子区域的顺式作用元件配对为基础，外显子于前体信使RNA(messenger RNA, mRNA)的侧面相接，形成反义剪接[5]。(2) RNA结合蛋白(RNA bindingprotein, RBP)驱动的环化： RBP识别并且结合内含子中的特定基序，通过RBP之间的二聚作用，外显子两端的剪接位点相互靠近，于前体mRNA的侧边成环[6-7]。(3) 套索驱动式环化： 分为两种，一种是前体mRNA在剪接过程中去除内含子，内含子形成套索结构，此类circRNA不包含外显子；另一种是由于外显子跳读形成套索，此类circRNA包含外显子[8-9]。circRNA广泛表达于人体的各种细胞、外周血、唾液和其他体液中，在某些情况下其表达水平要比相关的线状RNA高10倍以上[5]。circRNA在分裂缓慢的组织细胞中丰度很高(如神经细胞或其他分化程度较高的细胞)，在分裂迅速的组织细胞中丰度较低(如癌细胞)[10-11]。由于没有游离端而增加了自身稳定性，且在多种体液中富集，circRNA成为非侵入性生物标志物的理想候选者。

1 circRNA的生物学功能

1.1 微小RNA(microRNA，miRNA)海绵作用

circRNA可以吸附并隔绝miRNA，阻止miRNA与mRNA的相互作用。如来源于CDR1基因的circCDR1AS，含有许多miRNA-7的结合位点，能够抑制miRNA-7对靶基因的调控[12]。

1.2 蛋白质支架作用

circRNA可以结合蛋白质，调控其活性。如来源于MBNL1基因的circRNA，包含许多MBNL1的结合位点。当MBNL1蛋白含量过高时，其转录本含量降低，转而生成更多circRNA来结合MBNL1蛋白[6]。

1.3 转录调控作用

Hela细胞与H9细胞中有一类circRNA亚型，主要定位于细胞核，通过与小核蛋白颗粒U1相互作用调控RNA聚合酶Ⅱ的活性，提高其亲本基因的转录水平[8，13]。

1.4 竞争性抑制作用

由于线状剪接与反义剪接的供体与受体相同，circRNA的产生是以牺牲线状mRNA为代价的。如果蝇S2细胞中提高线状mRNA的含量会导致circRNA的表达水平降低[6]。

1.5 蛋白质合成模板

circRNA缺乏典型的5′帽子结构及3′poly A尾，无法被翻译。但序列中引入内部核糖体进入位点可使蛋白质翻译起始不依赖于5′帽子结构，circRNA也可以被翻译成蛋白质[14-16]。

2 circRNA与心肌梗死后心力衰竭

左室重构和心功能障碍是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后常发生的并发症，如何对其准确预测是一个临床难题。Vausort等[17]通过检测心肌梗死相关circRNA(myocardial infarction associatedcircular RNA, MICRA)，预测心肌梗死后心力衰竭的发生率。定量反转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerasechain re-action, qRT-PCR)检测结果表明，AMI患者外周血液中的MICRA表达水平显著低于健康志愿者。综合多种变量建立AMI后左室功能衰竭的预测模型，引入MICRA可以改善其预测功能，其综合判别改善指数[18](integrated discrimination improvement, IDI)为0.07。研究发现，左心室射血分数(ejection fraction, EF)≤40%的AMI患者，外周血液中的MICRA水平显著低于EF>40%的AMI患者(P<0.001)[19]。有序回归多变量分析提示，MICRA和AMI后心功能障碍有着密切关系，MICRA能够预测AMI后的心力衰竭。精准医学时代，准确预测患者AMI后心力衰竭的发生风险，可以提前干预，提高治疗效果，有助于医疗资源的合理分配。

3 circRNA与术后心房颤动

心房颤动(atrial fibrillation, AF)是冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting, CABG)后最常见的并发症之一。术后心房颤动(postoperative atrial fibrillation, PoAF)的发生率与发病率、死亡率以及总治疗费用显著相关[20]。为了预防PoAF，临床上常进行药物干预，考虑到药物副作用，对高危患者的干预更有意义。高龄是PoAF公认的危险因素，体质量指数[21]、高血压、糖尿病[22]、左心房增大等也是危险因素，但目前还没有能够被广泛接受的预测PoAF的风险模型。Zhang等[23]应用高通量技术分析患者CABG手术前1周的血样，通过对比PoAF与非PoAF患者的检测结果，发现9种circRNA明显表达差异。扩大样本量(365例)应用qRT-PCR对这9种circRNA进行验证，发现hsa_circ_025016与PoAF强相关性。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)分析显示，hsa_circ_025016预测PoAF的灵敏度为73.5%，特异度为77.8%，曲线下面积(area under curve, AUC)为0.802，表明 hsa_circ_025016对PoAF有预测效能。Harling等[24]研究表明，外周血液中的miRNA-483-5p表达水平是预测PoAF的潜在生物标志物。与miRNA相比，circRNA由于缺乏游离端而对核糖核酸酶R具有抗性，不容易被降解，其作为PoAF诊断和预后的生物标志物具有更稳定的优势[23]。

4 circRNA与冠心病

冠心病(coronary artery disease, CAD)是全球高发病率和高死亡率的心血管疾病，早期诊断CAD的意义重大。目前冠状动脉造影术(coronary arteriography, CAG)是诊断CAD的金标准[25]，但这种方法是有创性检查，费用较高，并不适用于低危患者的筛查。心电图(electrocardiogram, ECG)作为无创性的检查，其灵敏度和特异度均比较低，诊断效能不佳。Zhao等[26]通过高通量技术分析CAD患者和健康志愿者的外周血，发现5个差异最大的circRNA。进一步研究表明，其中hsa_circ_0124644的表达水平与CAD的严重程度相关，SYNTAX评分越高，hsa_circ_0124644的含量也越高。ROC曲线分析发现hsa_circ_0124644诊断CAD的灵敏度为0.861，特异度为0.626。引入CAD的相关危险因素，如吸烟、高血压、糖尿病、低密度脂蛋白和总胆固醇，调整后的灵敏度为0.759，特异度为0.704。Li等[27]通过高通量技术研究CAD患者和健康志愿者的外周血，发现2036个差异表达的circRNA，选取其中差异最大的5个circRNA，qRT-PCR发现其中hsa_circ_11806-28、hsa_circ_6510-1和hsa_circ_11783-2的差异有统计学意义，引入相关危险因素后通过Logistic回归分析表明hsa_circ_11783-2与CAD具有相关性。Deng等[28]通过高通量技术比较AMI患者和健康志愿者外周血中的circRNA，发现hsa_circ_081881表达水平差异最大。基因本体论(geneoncology, GO)分析发现hsa_circ_081881有7个miRNA-548位点，可以起到miRNA海绵吸附作用，抑制miRNA-548对血浆中过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)γ蛋白表达的调控作用，使得PPAR γ表达增加，进而减少泡沫细胞的形成。因此hsa_circ_081881可以作为AMI诊断的潜在生物标志物。

5 circRNA与室间隔缺损

室间隔缺损(ventricular septal defect, VSD)是常见的先天性心脏病，是各种原因导致室间隔在胚胎时期发育不全，形成异常交通，在心室水平产生左向右分流。随着对VSD研究的深入，非编码RNA在心脏发育中起着重要的作用[29]。Liu等[30]收集6例流产胎儿(24～28周)，在胎儿期应用超声诊断是否患有VSD，胎儿流产后解剖确认，将其分为VSD组和非VSD组(每组3例)。应用高通量技术，分析两组心肌中circRNA表达的差异，发现6234个差异表达的circRNA。从20个表达差异最大的circRNA中随机选择5个circRNA并通过qRT-PCR进行验证，其差异表达的趋势与高通量技术的结果一致。综合GO分析结果，发现差异circRNA含有许多miRNA-30c结合位点。上调的miRNA-30c被报道可通过相关信号通路影响胚胎发育和P19细胞的分化，影响增殖和凋亡的平衡[31]。circRNA可以作为miRNA-30c的海绵，参与心脏疾病的发生和发展。这些差异表达的circRNA具有筛查诊断VSD的潜在临床应用价值。

6 circRNA与原发性高血压

原发性高血压(essential hypertension, EH)是最常见的一种发病率高、危害性大的心血管疾病。EH的危险因素有很多，目前比较明确的有年龄、性别、区域和社会经济状态[32-33]，遗传因素也是目前研究的热点。Bao等[34]根据CircBase数据库的生物信息学分析，提示hsa_circ_0037911和EH的发生、发展高度相关。通过检测EH患者和健康志愿者外周血，证实hsa_circ_0037911表达水平在两组中有显著差异。Bao等还发现hsa_circ_0037911的表达水平与血肌酐的浓度有着显著的正相关性(相关系数r=0.294，P<0.0001)。Santhanam等[35]发现血肌酐和血压有着紧密的关系，血压随着血肌酐升高而升高，血肌酐升高也是高血压的危险因素之一。结合Santhanam等关于血压和血肌酐的研究结果，推测hsa_circ_0037911可能通过血肌酐浓度影响血压[34]。Liu等[36]收集EH组(n=5)和对照组(n=5)的血液标本，高通量分析发现287个异常表达的circRNA。选取其中表达上调的hsa_circ_0126991和表达下调的hsa_circ_0041000，在另外的EH患者(n=89)和健康志愿者(n=89)中扩大验证，发现hsa_circ_0126991的表达水平显著升高，而hsa_circ_0041000的差异无统计学意义。ROC曲线分析提示hsa_circ_0126991可以作为预测EH的生物标志物，灵敏度0.724，特异度为0.673。

7 circRNA与子痫前期

子痫前期(preeclampsia, PE)是妊娠期高血压的一种，不仅影响孕妇全身多个器官，而且严重地影响胎儿的生长、发育，引起生长受限、早产甚至死亡[37]。Jiang等[38]通过高通量技术分析PE患者和健康志愿者的血样，发现2178个差异表达的circRNA，进一步验证发现hsa_circ_0001855和hsa_circ_0004904在PE患者中显著升高。酶联免疫测定怀孕相关血浆蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A, PAPP-A)，发现PE组中PAPP-A表达水平比健康志愿者显著升高[(65.78vs41.38) pg/mL,P<0.05]。单独应用circRNA(AUC=0.621)或PAPP-A(AUC=0.728)预测PE效能不佳；联合应用circRNA和PAPP-A建立预测模型，具有更好的预测效能(AUC=0.940)。Hu等[39]通过高通量技术分析胎盘组织，发现8553个差异表达的circRNA，其中hsa_circ_0036877在PE患者胎盘组织中的表达水平低于健康志愿者。进一步研究发现hsa_circ_0036877在PE患者外周血中的表达水平显著高于健康志愿者。hsa_circ_0036877预测PE(AUC=0.846)，其灵敏度和特异度分别为85.3%和72.7%。Zhang等[40]在另外的研究中发现hsa_circ_101222联合应用血浆蛋白因子内毒素诊断PE，具有更好的预测效能，其诊断的灵敏度为70.73%，特异度为80.49%，AUC=0.876。

8 展 望

circRNA是一类特殊的双链闭合RNA，与线状RNA相比，在生物体内相对稳定[41]。一些临床研究提示circRNA在AMI后心力衰竭、PoAF、CAD、AMI、VSD、EH、PE等心血管疾病的诊断和预警中具有潜在临床应用价值。当然这些研究还存在着一些不足之处： AMI后心力衰竭研究缺乏对MICRA诊断价值的评估，患者临床基线资料不完整；PoAF研究没有对hsa_circ_025016相关信号通路进行深入研究，其调节AF的潜在机制需要探索；CAD诊断方面研究是单中心研究，易受当地环境和人文因素的影响；AMI方面研究没有扩大样本量验证circRNA的诊断作用；circRNA与VSD的研究没有证明circRNA可以直接调节心脏发育，也没有发现对mRNA或miRNA的影响；预测EH研究中临床样本量太小，且没有根据患者体质量指数进行配对。更大样本量、更多临床中心的研究才能更加令人信服地证实circRNA在心血管疾病中的诊断预警作用，同时也需要更多的基础研究以阐明circRNA在心血管疾病发生发展中的生物学作用。