索拉非尼对肝癌细胞增殖凋亡及JAK-STAT信号通路的影响

程秀莲 韩利峰 唐秀丽 赵娜 刘宁宁

索拉非尼作为晚期肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的独特靶向药物,可抑制肿瘤细胞增殖和血管生成[1-2]。JAK蛋白与多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)细胞的存活和增殖有关[3]，Janus蛋白酪氨酸激酶/信号转导和转录活化蛋白(kinase/Signal transducers and activators of transcription, JAK/STAT)信号通路是生长因子和细胞因子信号传导过程中必不可少的部分，已经成为许多免疫、炎症、肿瘤和造血疾病的具有吸引力的靶标[4]，因此，JAK / STAT信号通路抑制剂可能为肝癌的治疗提供新策略。本研究旨在探讨索拉非尼对肝癌细胞株HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1细胞活性的抑制作用和细胞凋亡的影响，以及对JAK / STAT信号通路蛋白表达水平的影响。

材料与方法

一、实验材料

肝癌细胞株HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1购自中国科学院上海细胞研究所，并于本实验室保存使用；索拉非尼由德国拜耳医药保健股份公司生产；胎牛血清( fetal bovine serum，FBS) 、DMEM 培养基、胰蛋白酶(gbico)购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；MTT购自上海如吉生物科技发展有限公司；DMSO由杭州碧云天生物科技有限公司生产；鼠抗人JAK2、STAT3、β-actin抗体购自Cell Signaling Technology公司；二氧化碳培养箱和流式细胞仪均购于美国Thermo Scientific公司。

二、 实验方法

(一)细胞培养

从超低温冰箱中取出各冻存细胞，解冻、洗涤、消化处理后，分别接种于含10% FBS的DEME培养液中(不含抗菌药物)，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，取对数生长期的细胞用于实验。

(二)MTT法检测索拉非尼对肝癌细胞的抑制作用

(1)不同浓度索拉非尼对肝癌细胞的抑制作用。分别将肝癌细胞HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1用培养基调节成细胞密度为3×106个/mL细胞悬液，每孔中接入100 μL细胞悬液，然后加入不同浓度的索拉非尼10 μL，实验组为不同浓度的索拉非尼组，其浓度分别为1.0、2.0、4.0、6.0、10.0和20.0 μmol/L，另外设加入等体积DMSO(索拉非尼溶剂)的孔为空白对照，不同细胞株和不同浓度分别设3个复孔。加入索拉非尼后细胞置于培养箱中继续培养48 h，实验结束前4 h 每孔加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h。用酶标仪在490 nm波长下测量各孔光密度值。细胞抑制率计算式：细胞抑制率=实验组OD值/空白对照组OD值×100%

(2)作用时间对细胞抑制作用的影响。分别将肝癌细胞HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1调节成细胞密度为3×106个/mL细胞悬液，每孔中接入100 μL细胞悬液，然后每孔分别加入10.0 μmol/L索拉非尼10 μL，另外设加入等体积DMSO的孔为空白对照，不同细胞株和不同作用时间分别设3个复孔。每种细胞株分别于培养24、48和72 h后加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h。用酶标仪在490 nm波长下测量各孔光密度值。细胞抑制率以(1)式计算。

(三)流式细胞仪检测索拉非尼对肝癌细胞HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1凋亡的影响。胰酶消化培养皿中各肝癌细胞株，经PBS缓冲液洗涤后，收集细胞调整密度至3×106个/mL细胞，以加入100 μL DMSO的细胞样品为对照组，以加入100 μL 10.0 μmol/L索拉非尼的细胞样品为试验孔，二氧化碳培养箱继续孵育30 min后，各细胞样品置于流式细胞仪中检测索拉非尼对细胞凋亡的影响。

(四)qRT-PCR检测索拉非尼处理对各肝癌细胞株中JAK2和STAT3 mRNA的影响。用10.0 μmol/L索拉非尼孵育各细胞株48 h后收集细胞，依据异丙醇沉淀法步骤提取细胞中RNA，按照2×SYBR real-time RT-PCR premixture试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)先用反转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板进行Real Time PCR扩增反应。反应条件如下：95 ℃预变性50 s，1个循环；95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环。实验引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计和合成。通过实时荧光定量 PCR 仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]收集PCR数据，采用相对定量的方法分析细胞株中JAK2和STAT3 mRNA的含量。

(五)Western bloting 检测各细胞株中JAK2和STAT3蛋白表达的变化 收集用索拉非尼处理48 h的HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1细胞株，经细胞裂解、离心后收集上清提取获得细胞株中的总蛋白，用增强型BCA 蛋白测定试剂盒在酶标仪中进行蛋白含量测定。上样缓冲液加入30 μg各细胞总蛋白，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS/PAGE)电泳、蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，分别先过夜孵育JAK2、STAT3和β-actin一抗，然后再孵育4 h辣根过氧化物酶标记的二抗，将PVDF膜放于暗室中滴加ECL化学发光液，在暗室中曝光、定影、显影，利用化学发光仪对Western bloting产生的条带进行定量分析。

三、统计学分析

结 果

一、索拉非尼对肝癌细胞的抑制作用

不同浓度的索拉非尼对HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1肝癌细胞进行处理，48 h后利用MMT法检测细胞活性，其HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1的半数有效浓度(IC50)分别为(13.17 ± 0.09)μmol/L、(9.28 ± 0.05)μmol/L、(11.97 ± 0.07)μmol/L、(8.49 ± 0.06)μmol/L和(10.54 ± 0.03)μmol/L，结果显示索拉非尼对试验5种肝癌细胞的活性均有抑制作用，而且随着索拉非尼浓度的升高其细胞抑制作用越大；在相同浓度和相同培养条件下，随着孵育时间的延长，索拉非尼的抑制作用也逐渐增加。此外，当索拉非尼浓度为20 μmol/L，孵育细胞时间为72 h时，其抑制效果最佳。

二、索拉非尼对各细胞株凋亡情况的影响

经DMSO和索拉非尼孵育后的细胞在流式细胞仪下检测，对照组细胞未出现大量凋亡，经索拉非尼处理30 min后的各试验细胞株均出现大量凋亡。从流式细胞仪结果可知，索拉非尼对各细胞株细胞凋亡影响的大小顺序为：Bel-7404 > MHCC97-H > SKHep-1 > QGY- 7701 > HepG2，差异有统计学意义(P< 0.01)。

三、索拉非尼对各肝癌细胞株中JAK2和STAT3 mRNA表达量的影响

用1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 和20.0 μmol/L浓度的索拉非尼分别处理HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1肝癌细胞株，结果显示，随着索拉非尼浓度的增加，JAK2和STAT3基因表达量逐渐降低，且降低程度也不尽相同，见表1。

四、Western bloting 检测各细胞株中JAK2和STAT3蛋白表达的变化

经10 μmol/L索拉非尼处理的各肝癌细胞株(HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1)用Western bloting检测JAK / STAT信号通路中蛋白表达结果显示，不同人肝癌细胞株中JAK2和STAT3蛋白表达水平与对照组相比均下降(P< 0.01)，且降低程度也不完全相同，见图1、表2。

表1 索拉非尼对各肝癌细胞株中JAK2和STAT3 mRNA表达量的影响(±s)

图1 不同肝癌细胞株中JAK2和STAT3蛋白的表达

表2 不同肝癌细胞株经索拉非尼作用后JAK2和STAT3蛋白相对表达量(±s)

讨 论

索拉非尼可有效治疗肝癌晚期患者，目前虽然索拉非尼与癌症相关蛋白激酶靶标建立联系的作用机制已被充分表征，但其在人类肿瘤中诱导了不同的反应，并且这种变异的原因尚不清楚[5-6]，而且索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡信号通路比较复杂。JAK/STAT信号通路参与肿瘤发生，之前研究表明，抑制JAK2/STAT3信号通路主要是通过抑制肝细胞癌的血管生成和转移来发挥抗肿瘤作用的[7]。Thomas SJ等[8]研究结果表明JAK/STAT信号通路在癌细胞激活过程中发挥重要的作用，JAK/STAT信号通路是一种重要的通路，被认为是治疗多种癌症的重要治疗靶点[9]。本研究分析了索拉非尼对HepG2、MHCC97-H、QGY- 7701、Bel-7404和SKHep-1等5种肝癌细胞株的抑制作用，结果表明索拉非尼能够抑制这5种细胞的活性，且能促进其细胞凋亡作用。由于 JAK/STAT信号通路在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要作用，本研究又探索了索拉非尼对JAK/STAT信号通路蛋白表达的影响，结果显示，索拉非尼对JAK/STAT信号通路蛋白的表达具有抑制作用，说明索拉非尼发挥抗肿瘤作用可能是通过JAK/STAT信号通路起作用的。

综上所述，索拉非尼对多种肝癌细胞均有效，其可能是通过下调JAK/STAT信号通路蛋白的表达发挥抗肿瘤作用，本研究可为索拉非尼发挥抗肿瘤作用机制提供实验依据。