黄腐酸在防治葡萄果实采后灰霉病中的应用

一、基本信息

1.专利号：ZL201010267273.4。

2.发明人：高灵旺、徐丹丹、习平根、于戈、姜子德、王琦、李文明、香梅、赵粮。

3.专利权人：中国农业大学。

4.授权时间：2018年6月8日。

5.技术领域：本发明涉及一种黄腐酸在防治葡萄采后灰霉病中的应用，属于生物技术领域。

二、发明内容

本发明的目的是提供黄腐酸在葡萄采后灰霉病防治中的应用，黄腐酸能够防治灰霉病菌侵染的果实，对果实病害发生和病情扩展具有显著防治效果。

本发明首先提供了黄腐酸在防治葡萄采后灰霉病中的应用。

具体应用中，将灰霉病菌侵染前或侵染后的葡萄浸泡于黄腐酸水溶液中。所述黄腐酸水溶液的质量体积浓度可为0～20 mg/mL，但不为零，如10 mg/mL；所述黄腐酸能够防治灰霉病，具体表现为提高葡萄中多酚的含量。

本发明还进一步提供了一种防治葡萄采后灰霉病的方法，包括如下步骤：

将灰霉病菌侵染前或侵染后的葡萄浸泡于黄腐酸水溶液，即实现对葡萄采后灰霉病的防治。所述黄腐酸水溶液的质量体积浓度可为0～20 mg/mL，但不为零，如10 mg/mL。

本发明通过选用不同浓度的黄腐酸溶液处理葡萄果实，然后接种灰霉病菌（Botrytis cinerea）。实验结果表明：黄腐酸处理后的葡萄果实灰霉病发生度显著下降；另外，通过在离体条件下选取黄腐酸处理葡萄灰霉病菌发现黄腐酸处理对病原菌的生长无影响，因此初步断定黄腐酸是通过诱导植物本身的抗性来达到防病的效果；最后，黄腐酸处理葡萄果实后提取果实的多酚总含量，发现多酚含量显著提升。结合黄腐酸的防效、多酚的抑菌活性及有益于人体健康，认为黄腐酸防治葡萄采后灰霉病的方法可行。

本发明采用的黄腐酸物质可用于葡萄采后灰霉病的防治，既可以单独使用，也可以与其他活性物质联合使用，以增强抗菌效果或降低其毒副作用，黄腐酸具有绿色、安全的特点，有益于人体健康，符合食品安全要求，起到了防治灰霉病及对果品的保鲜作用。

具体实施方式如下：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；下述实施例中所用的供试病原菌：供试葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea均分离于发病的葡萄果实，保存于马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）上；下述实施例中所用的黄腐酸试剂购自麦克林生化科技有限公司，纯度为85%。

实施例1：黄腐酸对采后葡萄灰霉病的防效实验

供试材料：供试葡萄品种“马奶”，购自市场。

将单粒葡萄果实人工分离，留有果蒂，选取大小、形状、成熟度一致的健康果粒于2%的次氯酸钠溶液中消毒2 min，然后用无菌水冲洗2次，晾干后分组处理。

（1）将葡萄果实分别置于不同浓度的黄腐酸溶液中浸泡10 min，每个浓度处理设置3个重复，每个重复处理30颗果实。

（2）自然晾干果实后将所有果实置于22 ℃下放置24 h。

（3）分别将葡萄灰霉病菌于PDA培养基上培养5天，然后在平板中加入无菌水冲洗和振荡，配制孢子悬浮液（浓度为3×104个/毫升）。

（4）人工刺伤果实，在伤口处接入10 μL的灰霉病菌孢子悬浮液。

（5）将各浓度处理的果实分别置于塑料保鲜盒中，喷雾保湿，置于22 ℃贮藏。

（6）贮藏4天和6天后，观察并记录果实的发病率及病斑直径，并计算其抑制率。抑制率（%）＝[（A-B）/A]×100，A为对照组发病率/病斑直径，B为处理组发病率/病斑直径。

实验结果表明：黄腐酸对葡萄灰霉病有很好的防效，且随着浓度的升高防效提高。供试浓度为10 mg/mL时，贮藏6天后对果实发病率的抑制率达到29.9%，对病斑直径的抑制效果高达42.6%。当黄腐酸的浓度为20 mg/mL时，贮藏6天后对果实发病率的抑制率达到61%，对病斑直径的抑制效果高达54%。

实施例2：黄腐酸对葡萄灰霉病菌菌丝生长的影响

用无菌去离子水溶解黄腐酸，然后分别加入至PDA培养基中配置成含有黄腐酸的培养基，以菌丝生长速率法测定不同浓度黄腐酸对病原菌菌丝生长的抑制作用。具体步骤如下：

用无菌去离子水作为溶剂溶解黄腐酸配置成母液，然后分别准确加入一定量的黄腐酸溶液至50 ℃融化的PDA培养基中混匀，使得培养基中黄腐酸的终浓度分别达到0.1、0.5、1、10和50 mg/mL，每个浓度处理设置3个重复，以加入相同体积的无菌去离子水作为对照。供试的葡萄灰霉病菌在PDA培养基上培养5天后，用灭菌打孔器在活化的病原菌菌落边缘打取菌龄、直径大小一致的菌饼（d＝6 mm），反接入含药平板中央，于22 ℃恒温培养箱中培养，定期观察记录实验结果。

实验结果表明：黄腐酸不影响葡萄灰霉病菌的菌丝生长，当黄腐酸浓度为50 mg/mL时，葡萄灰霉病菌的菌丝生长直径与对照无显著差异。

实施例3：黄腐酸对葡萄果实多酚含量的影响

用无菌去离子水溶解黄腐酸使其终浓度达到10 mg/mL，将葡萄果实于黄腐酸溶液中浸泡10 min后取出晾干，以相同体积的去离子水处理葡萄果实作为试验对照。于22 ℃下放置24 h后，参照实施例1的方法接种葡萄灰霉病菌孢子悬浮液，然后置于22 ℃的黑暗条件下培养，每隔12 h定期对各处理的葡萄果实取样，以备多酚物质含量的提取测定。

葡萄果皮多酚总含量的提取测定方法如下：人工从取样的葡萄果实上分离果皮，用滤纸吸干水分，于液氮中速冻并研磨果皮至粉末，加入8 mL 80%甲醇溶液进行多酚的提取。将提取液于28 ℃下震荡混匀（200 rpm）90 min，于4 ℃下离心（12000 g）10 min，搜集上清，作为多酚物质的粗提液。多酚总含量的测定采用福林-酚比色法，加入184 μL水至24 μL粗提液中，然后加入12 μL福林-酚溶液，室温下放置3 min，加入30 μL 20%的Na2CO3溶液，40 ℃下放置2 h后于765 nm下测定吸光度。以没食子酸为标样绘制标准曲线，进而求得提取液的多酚总含量。

实验结果表明：黄腐酸处理提升了葡萄果皮的多酚总含量，且随着病原菌接种时间的延长，多酚总含量呈上升趋势；当病原菌接种36 h后，黄腐酸处理下多酚总含量最高。

三、背景技术

葡萄是一种重要的经济作物，其用途涉及酿酒、鲜食及果干等方面，与国民经济的发展及人身健康密切相关。但是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引发的灰霉病作为一种重要的植物病害，在葡萄上主要危害葡萄花穗及果实，引发落花、落果及果实腐烂，严重影响了葡萄的采后储运，限制了葡萄产业的发展。

目前在葡萄的采后处理上，主要是通过SO2熏蒸来达到防治病虫害的目的，但是由此引发的果实品质的改变及SO2残留对人身的危害等问题不容忽视。因此，迫切需要探索新型的替代方法来防治葡萄采后灰霉病。

植物的诱导抗性防治主要是通过体外喷施各种诱导剂提高作物本身对外界逆境及病虫害的抗性，常见的诱导剂有Si、壳聚糖和一些生防菌剂等。黄腐酸作为腐植酸中一类可溶于水的物质，在农业生产上因其可作为土壤施用肥料改善土壤性质、提高作物产量和增强作物抗性等卓越性能而备受关注，其中常见的黄腐酸肥有黄腐酸钾和黄腐酸钠。另外，黄腐酸作为医药行业常用的药剂辅剂，对胃肠炎、风湿病和关节炎等均具有一定的疗效，有益于人类的健康。