对新型冠状病毒肺炎康复期核酸检测阳性的认识

裴银辉，张 杰（华北理工大学基础医学院，河北 唐山 0630；唐山弘慈医院综合内科，河北 唐山 06300）

2019年12月，在武汉发现了由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染的肺炎疫情，国务院随即将新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）纳入法定传染病。此次SARS-CoV-2是一种以前尚未在人类中发现的新型冠状病毒。2020年1月6日，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所成功自临床患者分离并培养出病毒，1月27日通过国家病原微生物资源库上传病毒电镜照片，随后发布了SARS-CoV-2核酸检测的引物序列和荧光探针[1]。此后，我国各版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》中将核酸检测作为诊断和解除医学隔离的重要实验室指标[2]。但近段时间来，陆续有多个COVID-19患者治愈后康复期核酸检测转阳的报道[3]，分析核酸转阳的可能原因及对策，可为后续《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》的修订及疫情防控决策提供参考。

1 核酸检测转阳的可能原因

1.1 实时荧光逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT-PCR）检测技术因素

国家卫生健康委员会发布的各版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》实验室诊断标准为咽拭子实时荧光RT-PCR核酸检测阳性，出院标准为连续2次（至少间隔24 h）呼吸道标本核酸检测阴性。SARS-CoV-2属套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）中的冠状病毒属（Coronavirus）。实时荧光RT-PCR在PCR反应体系中加入荧光标记探针，选择针对冠状病毒属高度保守的开放读码框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleoprotein，N）2个基因区域的引物扩增冠状病毒属特异核酸序列。

Target 1（ORF）：

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA；荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGBHQ1-3'。

Target 2（N）：

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。

利用荧光信号实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[4]。患者出院前（即第一阶段）病毒核酸检测阴性包括两种情况：假阴性和真阴性。从核酸PCR检测技术分析，出现假阴性的可能原因包括：①标本采集部位不当，如采集口咽拭子时，采集深度不够，未采到鼻腔深处等；②标本保存及运送过程不当，致使病毒RNA降解；③病毒RNA提取效率低；④核酸检测灵敏度不够，低拷贝量病毒核酸不能检出；⑤部分厂家的试剂产品由于研发时间短，未使用已知临床样本进行必要的性能测试，可能存在试剂优化不充分以及试剂批间差异大等问题；⑥临床实验室的规范操作、结果判读和质量控制等。由于以上原因核酸检测显示为阴性，但实际上患者体内仍然有病毒的存在，如果按照诊断标准出院，就会有传染的风险。此阶段核酸检测为真阴性的可能性是存在的，因为：①经过积极抗病毒药物治疗，患者体内病毒不再复制；②患者免疫力发挥抗病毒作用，通过细胞免疫或体液免疫清除病毒。真阴性表明患者已治愈，同时无传染的风险。

患者康复期（即第二阶段）核酸检测阳性同样包括两种情况：假阳性及真阳性。出现假阳性的可能原因包括：①标本RNA提取过程污染；②PCR扩增体系配制过程发生气溶胶污染；③尽管实验过程中应用了双靶标特异扩增及荧光探针检测，核酸检测的特异性得到很大提高，但同其他检测方法一样面临着样本中非特异干扰的存在[5]；④核酸检测中用荧光物质作为标记物，标本中可能由于本底非特异荧光物质的干扰而导致荧光信号增强；⑤不同批次检测试剂、室内质量控制等也可能是康复期核酸检测结果出现假阳性的原因[6]；⑥由于PCR两个引物扩增的核酸序列为冠状病毒属特异序列，并不是SARS-CoV-2的特异序列，因此，可能会检出同属其他冠状病毒的核酸而成为假阳性。根据流行病学及临床特点，中国目前不可能有这些病毒感染，故排除这种假阳性。由上述原因造成的假阳性结果会导致对康复期患者做出疾病状态的错误判断，增加治疗及防护成本。

类似地，患者康复期检测真阳性的原因主要包括：①部分患者免疫功能缺陷或降低，免疫系统不能产生足够的保护性抗体，病毒在体内增殖而引起复发；②第一阶段检测中出现的假阴性结果在第二阶段被正确检测。这部分真阳性病例体内有病毒复制，存在传染风险。

1.2 康复期呼吸道纤毛柱状上皮细胞排出病毒核酸片段

呼吸道气管与支气管管壁组织学结构相似，由黏膜、黏膜下层和外膜组成。黏膜表面为假复层纤毛柱状上皮组织，主要由纤毛细胞、杯状细胞、基细胞、刷细胞和弥散的神经内分泌细胞等组成。纤毛细胞呈柱状，每个细胞游离面约有300根纤毛。纤毛由下呼吸道向上呼吸道方向快速摆动，将呼吸道分泌的黏液物质及附于其上的病毒、细菌及尘粒等异物推向咽部，以咳嗽的方式排出。杯状细胞顶部胞质内含大量黏原颗粒，细胞分泌的黏蛋白与管壁内腺体的分泌物在上皮表面共同构成一道黏液性屏障，黏附吸入空气中的异物。基细胞呈锥形，位于上皮深部，为具有增殖和分化潜能的细胞，可根据代谢需求定向分化为纤毛细胞和杯状细胞。SARS-CoV-2进入呼吸道后，由于病毒表面特异蛋白与呼吸道上皮细胞表面受体特异结合，吸附于上皮细胞，然后通过穿入、脱壳、生物合成、组装成熟等环节，最后由宿主细胞释放大量子代病毒，再感染其他上皮细胞，导致气管和支气管黏膜发生慢性炎症病变，出现纤毛细胞减少，上皮纤毛运动减弱，甚至出现假复层纤毛柱状上皮化生为复层扁平上皮，失去由下呼吸道向上呼吸道逆向摆动排出异物的能力[7]。在COVID-19患者治疗过程中，应用正压氧纠正因COVID-19低氧血症所导致的黏液性物质向呼吸道深部聚集现象，同时急性期呼吸道上皮细胞由于受病毒感染引起严重损伤，导致堆积在呼吸道被黏液黏附的病毒及核酸片段无法及时排出[8]。这一现象从近日开展的COVID-19患者尸体解剖中肺部切片呈现大量黏液性分泌物得到进一步的证实[9]。尽管通过治疗及患者自身免疫功能的恢复，患者临床症状得到有效控制，肺部炎症改变吸收，但气管上皮细胞组织及功能的恢复需要一定时间，由纤毛逆向摆动至咽部的功能无法发挥，因此部分滞留在下呼吸道的病毒或病毒核酸片段无法通过咽拭子收集，导致核酸检测结果为阴性（假阴性）而达到出院及解除医学隔离标准。当患者处于康复后期，随着气管与支气管组织结构修复及功能恢复，之前滞留于呼吸道的病毒或病毒核酸片段又通过纤毛细胞的摆动进入咽部，咽拭子中检测到特异核酸片段，故病毒核酸检测呈阳性（真阳性）。

1.3 分泌型免疫球蛋白A（secretory IgA，sIgA）结合病毒康复期解离

人体经呼吸道感染SARS-CoV-2后，抗原提呈细胞捕获病毒，并在抗原提呈细胞内加工、处理抗原，将抗原信息提呈B淋巴细胞，由B淋巴细胞分化为浆细胞，合成并分泌包括IgA在内的多种免疫球蛋白[10]。IgA分为血清型和分泌型两种，其中sIgA是呼吸道黏膜局部发挥保护作用的主要免疫球蛋白。sIgA为双聚体，每个sIgA分子含两个单体IgA、一个J链和一个分泌片。J链通过倒数第2位二硫键将2个IgA单体连接为二聚体，分泌片缠绕在IgA二聚体的结构上使之形成稳定连接并不易被酶解的分子，有助于sIgA在黏膜表面保持抗体活性[11]。sIgA性能稳定，在局部浓度大，能抑制病原体和有害抗原黏附在黏膜上，阻挡其进入体内。同时也通过其介导的调理吞噬和溶解作用，构成了黏膜的免疫防御屏障。与其他类型免疫球蛋白相比，IgA铰链区较短，因此不易被酶解破坏，其半衰期较长（仅次于IgG）[12]。初次受到病毒攻击后，从抗原提呈到免疫细胞活化并启动适应性体液免疫应答需要较长时间（1～2周），合成并分泌在呼吸道黏膜表面的sIgA通过其抗原结合片段特异结合病毒表面抗原，阻止病毒侵入敏感细胞，病毒由于无法进入宿主细胞而不能完成子代病毒增殖。在COVID-19的发展及治疗过程中，随着机体免疫功能的发挥，早期通过合成干扰素抑制病毒增殖，1周左右合成IgM，2周左右合成IgG，这些免疫球蛋白通过调理吞噬、补体依赖性细胞介导的细胞毒效应及抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应发挥抗病毒活性，同时，CD+8 CTL特异杀伤病毒感染细胞，病毒感染得到有效控制[13]。在药物的积极治疗下，病毒感染引起的组织器官损伤得以控制并逐渐恢复，临床症状逐渐消退，肺部炎症吸收，但此时，与sIgA结合的病毒尚存在于呼吸道黏膜局部，因此，部分患者此时行咽拭子检测就未能检测到病毒核酸，出现假阴性。在患者康复期，由于sIgA被酶解，与之结合的病毒（可能由于sIgA的作用病毒已失去感染性）或核酸片段释放出来，通过呼吸道纤毛的摆动排出，这时咽拭子中可能会含有病毒核酸或片段，RT-PCR检测结果呈阳性。

2 应用其他诊断方法评估康复期核酸检测阳性的意义

由于核酸检测靶点为SARS-CoV-2的2个冠状病毒属特异RNA保守序列，其关注的是病毒核酸片段而不是完整的病毒颗粒，因此，COVID-19患者出院后康复期即使检测到病毒特异核酸片段，也无法对标本来源者是否发生感染或具有传染性做出准确判断，有必要结合其他诊断方法以准确评估核酸检测阳性的意义，为诊疗标准修订及疫情防控决策提供参考。有鉴于此，其他诊断手段应着眼于明确康复期咽核酸阳性拭子中是否存在具有感染性的完整病毒颗粒。以此为出发点，可以考虑对康复期核酸检测阳性标本进一步通过病毒培养或双位点抗体夹心酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法进行检测，综合实验结果进行分析。①病毒培养：咽拭子标本通过抑菌处理，接种冠状病毒敏感细胞株，观察病毒致细胞病变效应，并通过电镜寻找病毒颗粒[14]。②双位点抗体夹心ELISA：预制的特异性抗SARSCoV-2S蛋白抗体包被固相载体，加入咽拭子样品后，再加酶标记抗SARS-CoV-2N蛋白抗体，最后加底物显色，通过酶对底物的分解程度定量检测病毒抗原含量。前者主要用于判断核酸检测阳性标本中是否含感染性病毒颗粒，但操作复杂、需要较长时间；后者操作简单、省时，可以判断是否含有病毒抗原。如果病毒培养显示病毒致细胞病变效应，提示标本来源者呼吸道仍存在完整的具有感染性病毒颗粒，同时具有潜在的传染风险；如无细胞病变效应或ELISA检测阴性，则表明核酸检测到的只是SARS-CoV-2核酸片段，标本中不含完整具有感染性的病毒颗粒，提示随访者无传染风险；而单一双位点抗体夹心ELISA阳性，只提示标本中含有病毒抗原，不能确定标本中是否含有感染性病毒颗粒。

3 结语

综上所述，由于RT-PCR方法固有的局限性，患者康复期病毒核酸检测由阴转阳是一个值得警惕的问题，对COVID-19患者康复期核酸阳性标本进行病毒培养或双抗体夹心ELISA检测，可以分析康复期核酸检测阳性的意义，进一步评估其应用价值。此外，也可以为后续《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》的修订及疫情管控决策提供重要参考。