蔗糖诱导拟南芥突变体rhd3合成花青素及基因表达分析

聂可心，李 微，李小龙，郭 嫒，张靠稳，王 静

（北方民族大学生物科学与工程学院/国家民委生态系统建模及应用重点实验室，宁夏银川 750021）

高等植物中，花青素是植物次生代谢产生的水溶性黄酮类色素，以苯丙氨酸为原料，经位于内质网上的多酶复合体合成，后转运至液泡储存[1]。花青素通常积累在叶、茎、花、果实以及种皮中，具有重要的生理作用。花青素可使植物花、果实及种子色彩艳丽，以吸引昆虫传粉和觅食；能够吸收紫外线防止植物受强光损伤；具有极强的还原性，可清除因胁迫产生的活性氧。对人类而言，花青素是一种天然、无毒的食用色素，且作为有效的自由基清除剂，具有抗氧化、抗衰老等生理功能[2]，在食品、医药及保健品中应用广泛。因此，花青素的代谢调节一直是研究的热点。

经研究人员的多年努力，人类对花青素代谢过程的遗传学和生物化学过程有了深入的认识。拟南芥中花青素的合成涉及多步酶促反应，编码这些酶类的基因称为结构基因，包括苯丙氨酸裂解酶（AtPAL）、查尔酮合成酶（AtCHS）、查尔酮异构酶（AtCHI）、黄烷酮-3-羟化酶（AtF3H）、二羟黄酮醇还原酶（AtDFR）和花青素合成酶（AtANS）等[3]。植物的发育阶段、外部的环境变化，通过影响调节基因的表达，调控结构基因的表达量。发挥调节作用的转录因子有三类，即MYB、bHLH和WD40[4]。三类转录因子形成MBW 复合体，在转录水平调控结构基因的表达，影响植物中花青素的含量[5]。其中，AtPAP1（MYB75）、AtPAP2（MYB90）、AtTT8（bHLH）、AtGL3（bHLH）、AtEGL3（bHLH）及AtTTG1（WD40）能够响应营养元素匮乏、强光、盐及干旱胁迫，调节拟南芥中花青素的含量[6-8]。蔗糖（sucrose，Suc）能够诱导花青素的合成。在发育的矮牵牛花冠中，蔗糖可诱导花青素合成通路的基因表达，促进花青素的合成[9]。蔗糖可促进葡萄中花青素的积累，其中信号分子Ca2+、蛋白激酶及磷酸酶发挥了调节作用[10]；蔗糖能够调节拟南芥下胚轴及叶片合成花青素，使之呈现紫色，MYB 转录因子AtPAP1 直接参与这个过程[11]。此外，拟南芥合成花青素的过程还受到赤霉素（GA3）、乙烯等植物激素调控[12-13]。

拟南芥AtRHD3（root hair defective 3）编码内质网膜蛋白，参与细胞内质网形态构建，与拟南芥的生长发育紧密相关[14]。花青素合成过程中的结构基因在内质网膜上形成多酶复合体，催化花青素的合成。若内质网膜蛋白基因AtRHD3 突变，能否影响花青素的合成尚不明确。本研究以蔗糖为诱导因素，比较拟南芥野生型Col-0 及突变体rhd3 中花青素的积累量，并通过实时荧光定量PCR 技术分析花青素合成通路中基因的表达差异，探究内质网在花青素合成过程中的调控作用，为研究花青素的合成调控提供新的研究思路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

拟南芥野生型Col-0为本实验室保存、突变体rhd3（Salk_025215）为南开大学胡俊杰教授馈赠。经播种繁殖后，收获突变体rhd3种子，经LP、RP 及LBb1.3“三引物”PCR 法[15]进行纯合鉴定后，结果确定纯合（图1），方可使用。引物序列登录SIGnAL（http：//signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html）查找获得，序列如表1 所示。

1.2 试验方法

1.2.1 植物材料培养 培养基：5 mmol/L KNO3、1 mmol/L H3PO4、1 mmol/L MgSO4、1 mmol/L CaCl2、1/2 微量元素、1/2 铁盐、1%琼脂糖；蔗糖含量分别为0、1%、3%和5%，其中含1%蔗糖的培养基为对照培养基（CK）。

直接播种法：将野生型Col-0 及突变体rhd3种子用75%乙醇消毒后，平铺于灭菌滤纸表面，晾干播种于含不同浓度蔗糖的培养基表面，4℃春化3 d。置于培养室竖直光照培养7 d，每2 d 观察1次。培养条件为25℃，12 h 光照/12 h 黑暗，光照强度125 μmol/（m2·s）。光照结束后，采集照片，测定花青素含量。

表1 引物列表

移苗法：将消毒后的野生型Col-0和突变体rhd3种子分别播种于对照培养基，4℃春化3 d。置于培养室垂直光照培养7 d，再分别将野生型Col-0幼苗和突变体rhd3 转移到含不同浓度蔗糖的培养基表面，继续光照培养4 d。培养条件为25℃，12 h光照/12 h 黑暗，光照强度125 μmol/（m2·s）。光照结束后，采集照片，测定花青素含量。

1.2.2 花青素含量的测定 分别收集CK 及各蔗糖浓度处理组培养的野生型Col-0、突变体rhd3 幼苗地上部分，准确称取鲜重，置于200 μL 含1% HCl的甲醇溶液中，4℃黑暗过夜抽提，再加入150 μL ddH2O、150 μL 氯仿，混匀，4℃，12 000 r/min，离心5 min，吸取上清液，用酶标仪分别测定每个样品在530 nm 及657 nm处的吸光度值，试验重复3次。花青素相对含量的计算公式

式中，Q为花青素相对含量；FW为样品鲜重（g）。

1.2.3 拟南芥总RNA 提取及cDNA 合成 采用移苗法培养植物材料，分别提取CK 及5%蔗糖处理的野生型Col-0 及突变体rhd3 幼苗的RNA，经1.5%琼脂糖凝胶电泳确认RNA 提取效果后，取1 μg 总RNA 反转录成cDNA。RNA 提取及cDNA 合成分别选择全式金TransZol Up 试剂盒与TransScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒。

1.2.4 实时荧光定量PCR 分析基因AtDFR、AtANS、AtUF3GT、AtPAP1、AtPAP2、AtTTG1、AtTT8和AtMYBL2 在野生型Col-0 及突变体rhd3 中的表达量，以AtActin2为参照基因。首先，采用Primer Premier 5 软件设计各基因的引物，如表1 所示。先通过常规PCR 分析各引物特异性，再进行实时荧光定量PCR。采用全式金TransStartRGreen qPCR SuperMix UDG 试剂，以2-△△Ct分析基因AtDFR、AtANS、AtUF3GT、AtPAP1、AtPAP2、AtTTG1、AtTT8和AtMYBL2 在蔗糖诱导前后的相对表达量。反应体系为：2×TransStartRGreen qPCR SuperMix UDG 10 μL，Primer F/R 各1 μL，cDNA 1 μL，超纯水7 μL。实时荧光定量采用三步法，50℃2 min；94℃10 min；94℃5 s，60℃30 s（此环节40个循环）；于60℃时采集荧光信号。

2 结果与分析

2.1 不同浓度蔗糖对野生型Col-0 及突变体rhd3花青素积累的影响

观察直接播种法中不同浓度蔗糖对野生型Col-0及突变体rhd3 花青素积累，发现蔗糖会影响野生型Col-0 及突变体rhd3 下胚轴及叶片中花青素的含量（图2a、图2b），随培养基中蔗糖浓度增加，直接播种的野生型Col-0 及突变体rhd3 幼苗下胚轴及叶片中紫色物质花青素积累量增加，蔗糖含量浓度为3%时，即可见到突变体rhd3 下胚轴花青素积累，野生型Col-0 及突变体rhd3 花青素相对含量分别为5.34、8.75，突变体rhd3 中花青素含量显著高于野生型Col-0。蔗糖浓度为5%时，野生型Col-0 及突变体rhd3 幼苗下胚轴及叶片中紫色物质花青素积累量均达到最大值，分别为10.27、19.82，具有显著差异（P＜0.05）。

待植物长至7 d，再分别将野生型Col-0 及突变体rhd3 幼苗移至含不同浓度蔗糖的培养基中，幼苗下胚轴及叶片中花青素含量随培养基中蔗糖浓度增加逐渐增加（图2c、图2d），当培养基中蔗糖浓度为3%时，野生型Col-0 与突变体rhd3 中花青素含量分别为0.07/0.22，突变体rhd3 中花青素含量高于野生型Col-0。当培养基中蔗糖浓度为5%时，植株幼苗花青素含量达到最大值，突变体rhd3 中的花青素含量显著高于野生型Col-0，分别为0.16/1.16（P＜0.05）。

2.2 花青素合成通路基因差异表达分析

分别提取对照培养及5%蔗糖处理的野生型Col-0 及突变体rhd3 幼苗的RNA，结果如图3a 所示，28S 与18S 条带清晰，可用于反转录。

以正常培养野生型Col-0 的cDNA为模板，对花青素合成通路结构基因AtDFR、AtANS、AtUF3GT及调控基因AtPAP1、AtPAP2、AtTT8、AtTTG1、AtMYBL2进行常规PCR，设计的9 对引物均能扩增出目的条带，结果如图3b 所示，可用于后续实时荧光定量PCR 的分析。

分析野生型Col-0 及突变体rhd3 中花青素合成通路结构基因的相对表达量，由图4可知，对照培养的野生型Col-0 及突变体rhd3 幼苗中的

AtDFR、AtANS 及AtUF3GT 基因相对表达量无显著差异（P＞0.05），经5 %的蔗糖处理后，3个结构基因表达量均显著升高（P＜0.05），在野生型Col-0 及突变体rhd3 中分别升高为对照培养时的5.0/16.0、3.8/13.2、38.4/78.4 倍。突变体rhd3 中，结构基因的升高程度高于野生型Col-0。

分析野生型Col-0 及突变体rhd3 中花青素合成通路中调节基因的相对表达量，由图5可知，正常培养的野生型Col-0 及突变体rhd3 幼苗中的AtPAP1、AtPAP2、AtTT8、AtTTG1 基因相对表达量差异不显著（P＞0.05）。经5%蔗糖处理后，4个调节基因均发生不同程度的上调，在野生型Col-0 及突变体rhd3 中AtPAP1、AtPAP2、AtTT8 及AtTTG1 分别上调至正常培养时野生型Col-0 的39.3/85.3、24.9/54.5、5.4/26.4，3.1/3.5 倍。其中3个调节基因在突变体rhd3 中的上调倍数显著高于野生型Col-0（P＜0.05）。AtMYBL2 在花青素合成中起负调控作用，正常培养时，突变体rhd3 中AtMYBL2 基因的表达量显著低于野生型Col-0 中的表达量（P＜0.05），仅为野生型Col-0 的0.6 倍，经5%蔗糖处理，野生型Col-0 中AtMYBL2 基因表达量下降为对照时野生型Col-0 的0.6 倍，突变体rhd3 中AtMYBL2 基因的表达量下降至0.5 倍，持续较低水平表达。

3 讨论与结论

蔗糖是花青素合成的重要诱导因素。蔗糖不仅能够促进拟南芥幼苗花青素的合成，还可使黄酮含量升高[16]。本研究中，随培养基中蔗糖含量的升高，野生型Col-0 中花青素的积累量升高。与野生型Col-0 相比，突变体rhd3 随培养基中蔗糖含量的升高，会更早、更多积累花青素。结果表明，内质网膜蛋白基因AtRHD3 在蔗糖诱导的花青素合成中发挥负调控作用。

转录组测序数据显示，90 mmol/L 的蔗糖能显著诱导花青素合成通路中AtPAL、AtC4H、AtCHS、AtCHI、AtDFR、AtANS、AtUFGT 及AtPAP1 的表达[11]。AtPAP1 的表达量与花青素合成通路结构基因呈正相关。分子生物学试验证明，MYB可与bHLH 及WD40形成转录复合体，结合在结构基因启动子区域，激活基因的表达，从而增加花青素的合成[17]。本研究中，5%的蔗糖能够显著诱导野生型Col-0 花青素合成通路中结构基因AtDFR、AtANS、AtUF3GT 及调控基因AtPAP1、AtPAP2、AtTT8、AtTTG1 的表达，且这些基因在突变体rhd3 中表达量显著上调（P＜0.05）。因此，蔗糖处理后突变体rhd3 中参与花青素合成的基因的超量表达，是其花青素过量积累的重要原因。

AtMYBL2 是一个R3-MYB 转录因子，在花青素合成过程中起负调控作用。除了受生长发育调节，AtMYBL2 的表达量与环境变化紧密相关，例如高光、低氮等均能影响基因的表达[18]。已有的研究表明，AtMYBL2 通过与AtTT8 结合，可形成抑制型L2BW 复合体，抑制花青素的合成。在植物的某一发育阶段或受环境刺激后，MBW 与L2BW 的动态含量，调节了花青素的含量[19]。蔗糖浓度升高可抑制AtMYBL2 的表达，有利于AtPAP1 与bHLH、WD40转录因子结合，启动花青素合成通路基因的表达，促进花青素积累。本研究中，突变体rhd3 的AtMYBL2表达量在正常及5%蔗糖处理时，均低于其在Col-0中的表达量。推测突变体中负调控因子的低表达，促进了转录激活复合体MBW 的形成，增加了突变体中花青素的合成。AtMYBL2 的表达量受植物激素GA3、乙烯等的调控，植物激素是否参与了突变体中过量积累花青素的过程，也是有趣的科学问题，是下一步研究的内容。