低谷蛋白水稻的淀粉颗粒扫描电镜观察及RVA谱特征研究

郭 涛，张焕霞，薛 芳，王海凤，姜艳芳，房文文，林香青，张士永

（山东省水稻研究所/山东省水稻工程技术研究中心，山东济南 250100）

水稻是我国最重要的粮食作物之一，种植面积大约占全部耕地面积的1/4，产量大约占粮食总产量的1/2。水稻种子主要由淀粉和蛋白质组成，淀粉含量占粒重的75%以上，蛋白质含量占粒重的7%～10%。水稻种子储藏蛋白是以稻米为主食人群的蛋白重要来源，依据其溶解特性可分为水溶性清蛋白、醇溶性蛋白、盐溶性球蛋白和可溶于稀酸或稀碱的谷蛋白。水稻种子中谷蛋白是最主要的储藏蛋白，占稻米总蛋白的60%～80%，是最容易被人体吸收的蛋白[1]。因此，提高谷蛋白含量能增加稻米中可吸收蛋白的含量，提升稻米的营养价值。然而，对于慢性肾脏病患者和并发肾脏机能损害的糖尿病患者，需要对蛋白质的摄入进行严格控制，摄入过高的可吸收性蛋白会增加肾脏负担，加速肾脏功能的衰退，导致病情恶化[2]。近年来，随着人们生活水平提高和饮食方式突然改变，肾脏病和并发肾脏机能损害的糖尿病患者人数的不断增加，低蛋白含量食品的市场需求越来越大。所以，培育低谷蛋白含量的水稻品种，满足特殊人群饮食需求，已成为水稻育种的一个热点[3]。

目前，国内多个研究机构已利用引进LGC-1 资源材料或新创制的低谷蛋白材料，培育出适合当地种植的低谷蛋白水稻新品种（系）。山东省水稻工程技术研究中心实验室前期引进了携带LGC-1 基因的HNG1种质资源，并将该基因定向导入到优良食味米品种圣稻735，培育出谷蛋白含量与资源材料相当的适宜黄淮稻区种植的低谷蛋白水稻新品种[4]。但目前还未有关于谷蛋白含量降低对稻米淀粉颗粒结构及淀粉RVA谱（rapid viscosity analyzer，RVA）的研究报道。山东省水稻工程技术研究中心试验利用前期培育的低谷蛋白水稻新品种圣稻LG03，通过比较其与背景亲本圣稻735 的淀粉颗粒结构、淀粉RVA谱特征，以期为阐明谷蛋白含量与淀粉结构及品质的关系提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以引自江苏省农业科学院种质资源库的低谷蛋白粳稻新品系2054为LGC-1 供体，与本实验室自育的优良食味水稻品种圣稻735 杂交、回交，并结合分子标记辅助选择，选育出食味品质优良的低谷蛋白新品系圣稻LG03[4]。

1.2 圣稻LG03 农艺性状和品质性状调查

试验于2017年在山东省水稻研究所试验基地进行。5月11日播种，6月26日移栽。单株材料株行距13 cm×26 cm，每行10株，每个材料种植5 行，用于调查农艺性状；小区材料株行距16 cm×26 cm，每穴3～4 苗，小区面积13.33 m2，每个材料种植3个小区，用于考察产量。

全区水稻籽粒90%以上的实粒黄熟为成熟日期，从播种日至成熟日的天数为全生育期。水稻成熟期随机选取5个单株，分别考察株高、穗长、主茎穗穗总粒数、实粒数，取平均值。脱粒后考察1 000 粒饱满籽粒的重量，重复两次，取平均值。分小区收获各材料，称重，测量水分，换算成14.5%含水量重量，取平均值，计算产量。

稻谷收获后，室温放置90 d，待品质稳定后加工成精米，计算精米率（锋速LTJM160 型精米机，上海青浦绿洲检测仪器有限公司）；用食味计测定精米蛋白质含量和直链淀粉含量（RCTA-11A 型，日本佐竹公司），实验两次重复，取平均值。稻瘟病抗性由天津市植物保护研究所鉴定。种子总蛋白提取采用SDS-PAGE 分析，具体参照郭涛等[4]实验方法和步骤。

1.3 淀粉颗粒扫描电镜观察

1.3.1 材料准备 将材料加工成精米，夹在开叉的镊子上，用刀背在样品的中部施压，使其自然断裂，用小刀切下断裂部分，制成3 mm 厚的样品，断面上用IB-23 型离子溅射仪喷镀金粉；

1.3.2 电镜观察 喷金后的断面用SUPRATM55 热场发射扫描电镜观察淀粉颗粒形状及结构，并拍照。电镜加速电压为5.0 kV。

1.4 淀粉RVA谱特征测定

将精米研磨成粉末（MM400 型，德国莱驰），过100 目筛子后备用。采用Perten 公司生产的StarchMaster 2 型RVA（rapid viscosity analyzer）快速测定，测定方法参照郭涛等[5]试验方法和步骤。

1.5 统计分析

表型数据均以该性状的平均值作为最终数值，用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0 分析软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 圣稻LG03 农艺性状及部分品质性状考察

考察新培育的低谷蛋白品种圣稻LG03 与背景亲本圣稻735 的农艺性状，每个材料调查5 穴，结果由表1可知，生育期、稻瘟病抗性无显著差异（P＞0.05），与亲本圣稻735 相比，圣稻LG03株高、穗总粒数、穗实粒数显著降低（P＜0.05），而千粒重、折合产量、穗长、直链淀粉含量略有升高，精米率、蛋白质含量等性状略有降低，无显著差异（P＞0.05）。田间观察长势一致，无显著差异。

表1 圣稻LG03 与背景亲本圣稻735 的农艺性状和品质性状比较

2.2 圣稻LG03 蛋白成分测定

圣稻LG03 与圣稻735 籽粒中总蛋白含量差异不大。利用SDS-PAGE 凝胶分析，考察材料储藏蛋白的组成，结果如图1 所示，圣稻LG03 的谷蛋白（包括谷蛋白前体、谷蛋白酸性亚基、谷蛋白碱性亚基）各条带较背景亲本圣稻735 均显著减少，与供体亲本HNG1 相当；圣稻LG03 中的醇溶蛋白比例显著提高，球蛋白含量略有增加。

2.3 谷蛋白含量降低对淀粉颗粒结构的影响

圣稻LG03 的稻米外观品质与背景亲本圣稻735无显著差异，籽粒外观表现透明，加工品质（糙米率、精米率和整精米率）无明显变化。利用热场发射扫描电镜在500 倍、1 000 倍和2 000 倍的视野下观察精米横断面的腹部、中部和背部淀粉颗粒形状及结构，结果如图2 所示，圣稻LG03 与圣稻735 的胚乳主要由复合淀粉颗粒组成，细胞充实饱满、无缝隙，淀粉颗粒，多面体，棱角分明，相互镶嵌，排列紧密；但与圣稻735 相比，圣稻LG03 的淀粉颗粒大小一致性较低，部分淀粉颗粒变小。结果表明，谷蛋白含量降低，对淀粉颗粒大小的一致性会产生一定的影响。

2.4 谷蛋白含量降低对淀粉RVA谱特征值的影响

由图3和表2可知，圣稻LG03 的谷蛋白含量降低，淀粉RVA 图谱整体呈下降趋势，峰值黏度、热浆黏度和冷胶黏度均显著减少。圣稻LG03 的崩解值和糊化温度降低，说明其淀粉颗粒的高温稳定性降低，这可能与其淀粉颗粒大小一致性降低有关；回复值和消减值增加，表明淀粉颗粒持水能力降低，回生性增加。到达峰值黏度的时间差异不大。

3 讨论

稻米胚乳是人们食用的主要成分，主要由淀粉和蛋白质组成。水稻种子储藏蛋白含量占粒重的7%～10%，是以稻米为主食人群的蛋白重要来源。稻米中储藏蛋白依据其溶解特性可分为溶于水的清蛋白（albumins），溶于稀盐溶液的球蛋白（globulins），溶于醇溶液的醇溶蛋白（prolamins）和溶于稀酸或稀碱溶液的谷蛋白（glutelins）。 谷蛋白占总贮藏蛋白的60%～80%，含量最高，醇溶蛋白占20%～25%，清蛋白和球蛋白含量最低[6]。随着人们生活水平提高和饮食习惯突变，肾脏病和并发肾脏机能损害的糖尿病患者越来越多，对于这类肾脏损伤患者而言，摄入过高的蛋白会增加肾脏负担，导致病情恶化[2]。因此，研究蛋白含量低的水稻新品种，特别是培育容易被人体吸收的谷蛋白含量低的水稻品种，已越来越迫切。

日本科学家利用化学诱变手段得到一个种谷蛋白含量显著降低的突变体NM67，利用该突变体培育出世界上第一个低谷蛋白含量水稻品种LGC-1，谷蛋白含量低于4%，与正常水稻品种相比，谷蛋白含量明显降低[7]。国内不同学者也利用该资源或新创制资源，培育出多个低谷蛋白含量的水稻新品系（种）。万建民等[8]利用LGC-1 材料为母本，培育出了国内第1个低谷蛋白水稻新品种W3660。陈达刚等[9]利用新培育的W3660 与优良籼稻品种杂交、回交，并结合分子标记辅助选择，将LGC-1 基因导入籼稻品种五山丝苗，选育出一个农艺性状优良的籼型低谷蛋白水稻新品系。郭涛等[4]通过引进资源，将LGC-1 基因定向导入优良食味米品种圣稻735，培育出适宜黄淮稻区种植的低谷蛋白水稻新品系。

表2 谷蛋白含量降低对淀粉RVA谱特征值的影响

蛋白质含量与稻米食味品质关系密切。兰静等[10]优化了稻米蛋白提取方法，发现蛋白含量相近、食味评分不同的品种谷蛋白电泳谱带无差异，而清蛋白电泳谱在70～105 kDa 处谱带存在不同，认为105 kDa是与稻米食味相关的谱带，谱带颜色越深，食味品质越好。石吕[11]以一组导入G1 基因和sd1 基因的近等基因系为材料，研究了水稻精米蛋白质含量与稻米品质变化的关系，结果表明，蛋白质含量与食味值呈极显著负相关，呈劣化稻米蒸煮食味品质的显著趋势。

淀粉占水稻胚乳的60%以上，淀粉RVA谱特性是评价稻米品质的重要指标，与蒸煮食味品质密切相关。国内不同学者就稻米RVA谱特征值与稻米食味品质的关系开展了许多研究[12-13]。舒庆尧等[12]研究认为，稻米的直链淀粉含量与消减值、回复值、热浆黏度和冷胶黏度呈显著或极显著正相关，与崩解值呈显著负相关，公认食味较好的优质品种往往崩解值大，而消减值很小，且多为负值；相反，食味差的品种崩解值往往较小，而消减值很大。胡培松等[13]建立了淀粉RVA 特征值与稻米蒸煮及食味品质性状的回归定量分析模型，在测定出RVA 特征值后，就可以通过分析软件自动计算出直链淀粉含量和胶稠度的预测值，对稻米蒸煮品质及食味品质进行快速鉴定。但到目前还未有关于谷蛋白含量降低对稻米淀粉颗粒结构及淀粉RVA谱特征值影响的相关报道。本研究中，圣稻LG03 谷蛋白含量显著降低，导致淀粉RVA谱整体下降，峰值黏度、热浆黏度、冷胶黏度、崩解值、糊化温度、到达峰值黏度时间均较圣稻735 减少，而回复值和消减值增加，这可能是由于谷蛋白减少导致的淀粉颗粒大小均匀度降低引起的，虽然电镜观察两者间淀粉颗粒形态无显著变化。下一步工作中，需通过考察不同灌浆阶段的淀粉颗粒和蛋白体结构，明确谷蛋白减少对淀粉颗粒和蛋白体的影响；考察谷蛋白降低对直链淀粉链长及支链淀粉分支结构的影响，进一步阐明低谷蛋白水稻品质变化的机理。

4 结论

圣稻LG03 与背景亲本圣稻735 的农艺性状基本一致，谷蛋白含量显著降低，淀粉颗粒大小均匀度降低，影响淀粉RVA谱特征值，使圣稻LG03 的峰值黏度、热浆黏度、冷胶黏度、崩解值、糊化温度均降低，而回复值和消减值升高，食味品质较圣稻735 略有降低。这为阐明谷蛋白含量与淀粉结构及品质关系提供了理论基础。

致谢：感谢南京农业大学王益华教授对本实验储藏蛋白分析提供的帮助。