基于COI基因对云南省勐海县叮咬人的蚋进行种类鉴定

孟锦昕，吉明胜，何于雯，李楠，王静林*

(1.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224；2.勐腊县勐捧镇农业综合服务中心，云南 勐腊 666309)

蚋属于昆虫纲，双翅目(Diptera)，蚋科(Simuliidae)，是医学昆虫中的重要类群[1]。蚋对人类、畜禽、啮齿类动物、野生动物等进行骚扰性吸血，并传播多种疾病。人被叮咬后出现红斑、水泡等，严重的可引发皮疹和过敏反应，并发过敏性哮喘和“蚋热病”，可传播多种人兽共患病，如盘尾丝虫病(河盲症)、欧氏曼森线虫病和禽鸟住白虫病等[2]。

我国常有蚋类昆虫叮咬人的事件报道，2004年，某海训部队遭到蚋的大量侵袭，引起战士皮炎，出疹率高达96.9%，发烧占3.0%[3]；2011年，登封市东华镇刘庄村70%～90%的村民遭受蚋虫叮咬，部分出现发热症状，大部分村民在2周左右痊愈，个别村民症状持续数月[4]；2019年，云南省中老越三国交界处蚋叮咬人并引发皮炎[5]。2019年8月，在云南省勐海县采集吸血昆虫时，采集人员被黑色昆虫叮咬引起皮炎，为了明确该地区叮咬人吸血昆虫种类，在当地采集吸血昆虫，并对其进行形态学和分子生物学鉴定，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集

2019年8月21日8:30—8:45，在云南省勐海县勐宋乡曼烈村(北纬22°31′，东经100°29′，海拔1262m)，采用人诱法捕捉吸血昆虫。将采集到的昆虫放入75%的乙醇中，4℃保存，带到实验室。

1.2 标本处理及形态学鉴定

在体视显微镜(OLYMPUS，SZ2-ILST)下切下昆虫翅膀，虫体放入含1%蛋白酶K的组织消化液中，56℃消化过夜[6]，消化液用于昆虫基因组DNA提取；虫体分别经过10% KOH透明，50%～100%乙醇脱水处理，压片，在光学显微镜(OLYMPUS，CX31)下观察昆虫形态特征，参照《中国蚋科昆虫》进行形态学鉴定。

1.3 蚋的分子生物学鉴定

上述消化液用动物组织基因组DNA提取试剂盒(天隆科技有限公司，西安)按照试剂盒说明书提取昆虫基因组DNA，取2μL DNA为模板用COI基因特异性引物进行PCR扩增[7]，电泳，阳性PCR产物送擎科生物科技有限公司(昆明测序部)测序。

1.4 序列分析

获得核苷酸序列首先在NCBI中进行Blast比对。在GenBank中下载16条蚋的COI基因核苷酸序列，使用DNAStar软件中MegAlign进行核苷酸同源性分析，用MEGA 6.1软件构建系统进化树(采用NJ法，bootstrap值为1000)和遗传距离分析。

2 结果

2.1 蚋形态学鉴定

15min内共采集到叮咬人的昆虫9只，编号为MH-1至MH-9，昆虫体形似蝇，虫体长约3～4mm，呈黑色(图1A)；额宽，复眼，口器厚而短，两条触须(图1B)；触角10节，成对排列(图1C)；翅透明，前缘脉具毛和刺，径分脉(Rs)末段不分叉(图1D、E)；中胸盾片棕黑色，呈拱形，盖以黄色柔毛，无黑纵条(图1F)；爪较长，无基齿(图1G、H)；腹部生殖板较宽，呈长方形，有受精囊，近似球形(图1I)；具有三叉头状的生殖叉突，两臂短、末端膨大(图1J)。

A B C

D E

F G H

I J

2.2 COI基因序列分析

测序拼接获得编号为MH-1至MH-9的9只蚋的COI基因序列462bp，在COI形成的数据矩阵中，所有样本之间的平均遗传距离为0.120。MH-1至MH-9的遗传距离在0.000～0.010，与参考序列S.nodosum的遗传距离在0.000～0.027；与参考序列S.undecimum(MH557844)相比距离均最远，在0.228～0.241(表1)。蚋COI基因核苷酸序列构建系统进化树，显示9只蚋与S.nodosum处于同一进化分支，且与S.nodosum(KP661445)遗传距离最近(图2)。

图2 云南省勐海县采集蚋COI基因核苷酸序列(462 bp)系统进化树

3 讨论

云南省勐海县位于云南省西南部，属热带、亚热带西南季风气候，年平均气温18.7℃，降雨量充足，动植物种类丰富，吸血昆虫种类多、密度大，经常有昆虫叮咬人引起皮炎的事件发生，且夏秋两季人或动物存在不明原因的多种疾病，因此，需要加强吸血昆虫种类调查及携带病原的研究。

本研究2019年8月21日在云南省勐海县勐宋乡曼烈村采集的9只昆虫与在云南省江城县采集的S.nodosum形态学特征相似[5]，虫体黑色，爪无基齿，径分脉不分叉，触角10节，生殖叉突为三叉头状，这些形态学特征提示，本次采集的蚋可能是S.nodosum。

《世界蚋类名录》记载全世界已知的蚋有2300余种[8]，陈汉彬报道我国已发现的蚋有333种[9]，之后仍不断有蚋类新种类被报道[6,10]。巨大的种类数量及高度的形态学相似性[11]，使得从形态学上鉴定蚋的种类变得极为困难。Hebert在2003年提出了DNA Bar-codes技术，即DNA条形码技术[12]，该技术以功能结构最为保守的线粒体细胞色素氧化酶I基因(COI)作为“条形码”，已广泛应用于双翅目昆虫的分类研究。何艳霞等已证实COI基因鉴定结果与形态学鉴定结果具有一致性，且COI基因鉴定法能较好的反映蚋亚属的种间关系[13]。本研究采用COI作为分子靶标对勐海县采集的9只吸血昆虫进行了分子鉴定，9只蚋与S.nodosum处于同一进化分支，与S.nodosum的遗传距离最小(0.000～0.027)，核苷酸同源性最高(>97%)，从分子生物学水平明确了本次采集的9只蚋均为S.nodosum。