支持细胞中雄激素受体信号传导的研究进展

王子铭，马铭钧，黄富硕，冯 瑞

（东北农业大学 动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

支持细胞（sertoli）作为众多体细胞中有且仅有的一种能与生精细胞产生联系的细胞，所拥有的紧密连接结构在雄性生殖过程中非常重要，可以维持和调节部分睾丸免疫功能，为生精细胞提供足够的雄性激素，同时为精子发生提供营养和能量。在雄性生殖过程当中，支持细胞对众多生殖细胞来说有着像“保姆”一样的功能，故称之“保姆细胞”。雄激素作为重要的一类生殖激素可以参与到支持细胞的生理活动中。雄激素受体（androgen receptor，AR）是雄激素发挥作用的重要中间物质，而支持细胞内的雄激素受体参与到众多生理活动，主要有保持血睾屏障（blood－testis barrier，BTB）的完整性、对生精细胞的减数分裂起到支持、参与生精细胞的黏附以及释放精子等作用。

AR本身属于类固醇激素核受体超家族，在众多家族成员中有5个属于脊柱动物，包括雄激素受体、雌激素受体（estogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、糖皮质激素受体（glucocorticoid receptors，GR）和盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor，MR）［1］。AR可以在有雄激素作用的组织（如前列腺、骨骼肌、肝脏和中枢神经系统［2］）中较好地表达；也可以被内源雄激素激活，包括睾酮（testosterone）和5α－双氢睾酮（5αhihydrotestosterone，DHT）。

1 AR的结构

AR基因位于X染色体Xq11～Xq12位点。这个蛋白被2 757个核苷酸编码，是由919个氨基酸组成的分子质量为110 kDa的复合物。共分成4个不同的功能结构域：氨基端结构域、脱氧核糖核苷酸结合结构域、Hinge结构域、羧基端配体结构域［1］。雄激素受体功能准确发挥作用是依靠各个结构域的完整性来实现的。

1.1 氨基端结构域

该结构域由第1～555位氨基酸组成。有多聚谷氨酰胺和多聚甘氨酸序列两个重复的序列包含在其中［3－5］。研究表明，多聚谷氨酰胺长度对雄激素受体蛋白的折叠有影响并且参与调控AR氨基端的结构［6］。AR的活性与多聚谷氨酰胺序列反复出现的次数有关，即多聚谷氨酰胺序列反复出现的次数减少可以在很大程度上提高AR活性，而AR活性的削弱是由多聚谷氨酰胺序列反复出现的次数增加造成的。

1.2 脱氧核糖核苷酸结合结构域

该结构域由第556～624位氨基酸组成。这个结构域包含两个锌指结构：第一个锌指结构包含一个P－BOXCAR（第577～581位氨基酸，GSCKV）序列，介入辨认DNA，联合特异性的应答元件；第二个锌指结构包括1个D－BOXAR（第596～600位氨基酸，ASRND），直接参与AR复合物的形成，有利于AR与脱氧核糖核酸相融合。

1.3 Hinge结构域

该结构域由第625～688位氨基酸构成，包含AR的入核序列。介入到AR入核的调控中，同时Hinge具备主要的磷酸化、乙酞化位点，介入AR转录后修饰。

1.4 羧基端配体结构域

该结构域亦称配体结构域（ligand binding domain，LBD），由第669～919位氨基酸构成。羧基端结构域由12个α－螺旋结构和2个β折叠结构参与组成，是高度保守的，参加辨认雄激素，同时与蛋白稳定性相关。研究表明，这个结构域带有肌动蛋白的结合基因序列，可与微管结合进而介导AR的核转移［7］。

AR的氨基端结构域是最易变的，而脱氧核糖核苷酸结构域是甾体激素核受体家族不同成员间最保守的结构域，所有甾体激素核受体的脱氧核糖核苷酸结构域由两个锌指结构组成。这些锌指结构有促进AR与调节AR的基因启动子和增强子区域脱氧核糖核苷酸结合的功能，从而以氨基端结构域和配体结合域的激活功能来刺激或抑制这些基因的转录。在甾类激素核受体家族中高度保守的脱氧核糖核苷酸结构域选择性地与雄激素反应元素相结合，激活特定的AR，配体结合域在核转录因子之间也有十分相似的结构，介导AR和热休克以及伴侣蛋白之间的相互作用，同时也与AR的氨基端相互作用以稳定结合雄激素。

2 AR与生殖障碍

虽然AR参与多种活动，但其主要功能与男性生理有关，如性别分化和性别特异性疾病。AR基因缺陷会导致雄性第二性征发育停止，并导致雄激素不敏感综合征，即体内细胞对雄激素的部分无应答或完全无应答。AR基因缺陷可由四种类型的突变（单点突变导致替换或过早终止密码子、核苷酸嵌入和丢失造成的突变、基因完全或部分缺失和影响AR基因RNA剪接的内含子突变）引起。目前，在人类AR基因中已发现1 029个不同的突变，主要分布在AR脱氧核糖核苷酸结合结构域和羧基端配体结构域编码区域。一些研究已经发现，肯尼迪病（也称为脊髓球性肌萎缩症）与AR中多聚谷氨酰胺序列的重复性有关，这是一种进行性神经退行性疾病。AR与乳腺癌、喉癌、肝癌和睾丸癌等癌症的关系成为当下研究的主要方向。

3 AR细胞内的转运

在没有配体反应的情况下，AR是无活性的，并且通过结构域与微管的相互作用而位于细胞质中。在雄激素的介入下，AR很快与配体相联系，发生构象变化，然后被与转运相关的细胞间蛋白识别，介导AR转运到质膜和细胞核［8－9］。目前对AR核运输的机制基本上已明了。小于40 kD的低分子质量蛋白质进行主动运输，依靠输入蛋白质家族的成员进行介导。包括AR在内的甾体类受体成员都被认为是经输入蛋白介导的转运机制开展运输。AR的hinge结构域具有经典入核序列信号（NLS），雄激素作用下AR发生构象改变，暴露其入核序列［10］。研究发现，除了importinα和importinβ在AR入核中起重要作用外，微管也参与AR的细胞核转运［11］，干扰微管的稳定性可以干扰AR的细胞核转运。这表明AR的细胞核转移需要微管功能的完整性。AR通过与动力蛋白相互作用，依赖于动力蛋白的功能快速向微管的负极移动，即近细胞核端，进而诱导AR在细胞核周围富集，更高效地与importinα和importinβ结合，完成快速入核。

4 支持细胞中AR的信号传导

AR在作为配体的睾酮作用下，在支持细胞中参与精子发生的四个关键时期，即减数分裂、维持溴麝香草酚蓝（BTB）、支持细胞与生精细胞的黏附以及精子的释放。在没有支持细胞AR的小鼠中，通常在减数分裂的粗线期或者双线期精子发生进程就停止了。在小鼠等啮齿动物中，AR含量通常在VⅡ～ⅥQ期达到最大峰值。在此期间，支持细胞中的AR介入了BTB的分解和重建。当没有雄激素刺激AR时，两种血睾屏障结构性蛋白（caveolin－1和Rab11）处于较低浓度状态，这就导致血睾屏障难以长时间维持下去［12］。支持细胞中的AR缺失可能导致生殖细胞处于异常状态，导致未成熟的生精细胞从支持细胞中过早解离。因为这种大量未成熟的生精细胞过早解离的堆积，导致成熟精子无法在Ⅷ期释放，最终被当成异常物质被支持细胞所吸收［13］。支持细胞中的AR主要通过两条信号通路发挥作用，一条是经典信号通路，一条是非经典信号通路。

4.1 经典信号通路及相关转录调节蛋白

正常状态下支持细胞胞质中的AR是与热体克蛋白结合的，自由扩散的睾酮与AR的配体结合结构域相结合，接下来导致AR结构改变并且同时与热体克蛋白分离。在细胞质中游离出的AR再次被转运到细胞核，与DNA上的雄激素反应原件（androgen response elements，AREs）联合，接下来与其他转录辅助因子相互作用启动基因转录翻译，这是经典途经，耗时较长。调控基因转录需要0.5 h，而蛋白翻译过程还需要花费数倍的时间［14］。但是AR还有一种快速方式弥补经典途径消耗的时间。在AR经典信号通路中，与不同的转录调节蛋白结合就可以调控AR的不同功能以及活性AR。在活化状态下，即当AR与激动剂联合时AR募集活化剂以增加其转录活性，包括类固醇类激素受体共调节因子（CREB结合蛋白、p300和p300／CBP结合因子等），进而协助完成高效转录［15］。在抑制状态下，即AR与颉颃剂联合时，AR会招募视黄酸和甲状腺激素受体沉默介质［16－17］、组蛋白去乙酞化酶等，削弱转录AR活性。

4.2 非经典途径

目前AR的非经典途径有两条方式被广泛关注，一条是由钙离子内流引起的细胞信号转导，另一条是MAP磷酸化级联反应。

支持细胞中某些相关酶和物质可以影响基因的转录，E.Gorczynska等［18］在1995年发现，在支持细胞内睾酮量增加会导致短时间内产生Ca2＋内流现象。磷脂酶C是一个依靠位于细胞膜上的G蛋白偶联受体与睾酮结合而被激活的酶，而细胞之间PIP2可以被磷脂酶C水解为IP，并生成二邻苯二甲酸甘油（DAG）。PIP2在被消耗后会引起K＋ATP通道开放。可以将PIP2看作是K＋ATP通道的抑制剂。同时支持细胞的细胞膜发生去极化。由于去极化而引起的细胞外膜电压的变化导致L型Ca2＋通道开放和大量Ca2＋进入［19］。以上这些支持细胞中的PIP2、磷脂酶C、Ca2＋流入量和DAG的变化都影响基因转录，进而对分泌生精细胞必需营养物、支持细胞与生精细胞链接、生精细胞的移动产生影响［20］。AR一样也可以通过一种耗时短的信号传导途径传递雄激素信号。由于AR中有一段多脯氨酸排列的区域可以使它与Src激酶的SH3结构域结合，该区域通过某种未知的细胞间途径磷酸化Src激酶激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）［21］。由于细胞膜上有丰富的Src激酶，这个反应通常发生在细胞膜上。但是由于AR广泛在细胞中存在，那么直接参与催化其磷酸化的AR是细胞膜附近的还是锚定在细胞膜上的，还有待研究。研究者在蛋白免疫印迹试验和共聚焦荧光显微镜观察中，都曾在细胞膜发现可以特定结合的AR［22］。EGFR磷酸化是MAP磷酸级联反应（Raf、MEK、ERK激酶）激活的前提，MAP磷酸化级联反应被激活后，ERK激酶就会导致p90Rsk磷酸化，随后激活CRE结合蛋白（CAMP response element binding protein，CREB）。在睾丸支持细胞中，CREB转录因子调控的Ldha、Egr1、Creb等基因［23］在睾酮作用后表达增加。但是这三个基因的启动子区域并不缺少ARE结构，这可以证明是一个非经典的雄激素途径指导完成活动。M.Scobey等［24］用含有缺陷的CREB腺病毒感染大鼠睾丸支持细胞，结果显示，处理组单倍体精细胞数量比正常组减少了四分之三。这表明在维持生精过程中CREB蛋白的活化也很重要。

4.3 PI3K／AKT通路

PI3K／AKT途径触及多种细胞进程，包含细胞生长和存活，并且是生长和发育的重要信号途径之一，被认为是控制细胞增殖、分化和存活的关键所在。AR还可以通过非基因组途径激活AKT，使用PI3K抑制剂可以抑制这种作用。AR的氨基端结构域可以在雄激素的催化下与Src联系，激活PI3K的p85a，直接激活PI3K。PI3K活化后AR与PI3K调节亚基p85a的亲和力上升，同时产生3，4－二磷酸磷脂酞肌醇和3，4，5－三磷酸磷脂酞肌醇。p85a与SH2亚基域连系以诱发AKT活化。Akt在PIP2的催化下生成均聚体，并达到部分活化状态。在PIP3和PH结构域的帮助下，Akt与细胞膜相关联并锚定在细胞膜上。同时，二聚体进一步增强Akt活性。Akt与细胞膜分离，使其进入细胞质，进一步激活下游信号级联，最终调节细胞的普遍功能。Akt是PI3K信号通路里最重要的下游信号转导分子之一，可以诱导下游分子（如GSK3p、PFK－2、mTOR、Bad，Forkhead等）变成有转录活性的状态。AR在PI3K－AKT信号通路中以这类方式调节细胞增殖，同时对细胞凋亡进行抑制。在LNCaP细胞中发现，AKT在雄激素作用的很短时间内被快速地激活，而AR在PC3（阴性AR细胞）中表达，并且还检测到快速AKT激活［25－26］。说明AKT激活是经由非基因组功能实现的。对AKT和AR之间相互作用的分析研究表明，AKT和AR的结合出现在浆细胞膜的结构中。干扰AR的浆细胞膜转染抑制了AR与AKT之间的相互作用，也抑制了AKT的激活［25］，说明了AR从细胞质向细胞膜转移过程中的变化对于PI3K－AKT通路的重要意义。

5 讨论

乙酰化、泛素化、磷酸化、甲基化、棕榈酰化和sumo修饰这些常见的转录后修饰也通常出现在AR的转录过程中。而AR在这些转录后的变化也影响受体自身功能的实现。在AR的核转移过程中可以发生磷酸化修饰，可以促进激活靶基因和其他生物学功能［27］。乙酰基修饰可以促进AR的核转移并诱导细胞增殖［28］。

不仅仅是AR可以与雄激素结合并作用于支持细胞，还有其他种类的受体也有同样的作用。1995年E.Gorczynska等［18］发现，用睾酮处理支持细胞会出现一种短时间内钙离子内流的现象。Gq型蛋白受体可以与睾酮结合，在支持细胞的细胞膜上发现了它的存在，它可以激活磷脂酶C74。细胞内PIP2被磷脂酶C 水解为IP，产生二甘醇（DAG）。PIP2作为一种K＋ATP通道的抑制剂，当生理活动需要消耗PIP2时，使支持细胞上的K＋ATP通道打开，并使支持细胞去极化。Ca2＋依赖性通道的开放以及随后出现的大量Ca2＋内流是去极化所引起的外膜电位变化引起的。对体内支持细胞相关基因转录产生影响的原因有很多，PIP2、磷脂酶C流入、Ca2＋、DAG等，Gq型蛋白偶联受体也在非经典AR通路中有很重要的作用。为了确定哪个受体触发了与AR转运有关的磷酸化反应。张增［29］使用一种特异性的AR阻断剂——氟他胺，使支持细胞中的AR失去作用，同时终止了细胞核膜之间的AR运输，结果表明，雄激素通过经典AR诱导的磷酸化级联反应参与了AR转运。在正常生理条件下，细胞质与AR中的Src激酶处于一种相对平稳的状态。A.T.Szafran等［30］在研究中发现，在睾酮刺激后的很短时间内Src激酶发生磷酸化，而AR在细胞核的定位和分布的减少是靠抑制Src激酶的磷酸化来实现的。这证明抑制Erk1／2磷酸化后，膜内AR的转运没有变化；而在MEK或Akt磷酸化被抑制后，AR在细胞膜与细胞核之间的转运被阻断，同时MEK或Akt磷酸化也影响了AR自身的运输。张增［29］的研究表明，Src激酶活性的减少可能是依靠抑制MEK或者Akt的磷酸化来实现的，微量的Src激酶抑制剂MPP1就可以完全抑制Src激酶活性，使得细胞核与细胞膜之间的AR转运受到有害的影响。这与MEK或Akt的受阻磷酸化没有区别。通过激活MEK和AKT激酶可以激活Src激酶，进而可以实现AR从细胞质向细胞核及细胞膜间进行转移的过程。

6 结论

随着社会经济结构的变化，养殖业呈现发展不均衡现象，很多经济欠发达地区的养殖环境差，影响公畜精液品质。如何提高公畜的繁殖力及生产效率，进而提高经济收入已经成为现在研究的主题。为了保证雄激素正常分泌和发挥作用，需要公畜保持性欲，产生健康、足量精子；而支持细胞AR缺失、功能损害和缺少雄激素都会影响公畜的繁殖能力。支持细胞中AR参与了多个精子发生的关键时期，例如血睾屏障的分解和重建都对生精过程产生重大的影响。而且人们对AR（特别是支持细胞中AR非经典途径）作用机制的了解还不够多，另有许多细节值得切磋探讨。