miR-154对结肠癌细胞EMT过程的影响及与结肠癌临床病理特征的关系

王春冉 胡石奇 罗祖洋

结肠癌是世界范围内第三大常见恶性肿瘤，其在50岁以上人群中的发病率超过20%，死亡率在10%以上[1-2]。随着靶向药物制剂的发展，对结肠癌早期诊断的分子生物学靶点的研究是治疗中晚期结肠癌的重要方向。MicroRNA(miRNA)是一类内源性表达的非编码RNA，由18～22个核苷酸组成，可以对靶基因3'-UTR端进行特异性识别，从而对下游靶基因进行降解或者阻断靶基因的翻译，在恶性肿瘤的发展中具有重要作用[3-4]。miR-154已被证实在非小细胞肺癌、前列腺癌等多种肿瘤发展过程中发挥调控作用[5-6]，但其在结肠癌中的作用尚未见报道。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞向间质细胞转化的过程，从而具备间质细胞的游走迁移和浸润能力，细胞形态与生物学特性均向间质细胞转化。上皮源性的肿瘤细胞可通过EMT过程获得相应的迁移与侵袭能力，这在肿瘤的转移中发挥着重要作用[7-8]。

本研究检测了miR-154在结肠癌发展过程中的表达情况，并对其可能存在的作用机制进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2018年7月至2019年5月于广州市第一人民医院结直肠肛门外科进行结肠癌手术的患者60例，术中取切除的新鲜结肠癌组织标本和距癌组织5 cm以上距离的手术远端切缘的癌旁组织，所有患者均经组织病理学确诊为结肠癌并首次进行切除手术，术前未经放疗、化疗等辅助治疗。纳入研究的患者基线资料：平均年龄(60.1±8.3)岁，其中60岁以上患者24例(40.0%)，60岁以下患者36例(60.0%)；男性患者35例(58.3%)，女性患者25例(41.7%)；按照国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)与美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)2017年联合发布的第八版TNM分期标准分期：Ⅰ、Ⅱ期：36例(60.0%)，Ⅲ、Ⅳ期：24例(40.0%)；组织分化程度：高中分化32例(53.3%)，低分化28例(46.7%)；有淋巴结转移者29例(48.3%)，无淋巴结转移者31例(51.7%)。

1.2 细胞、试剂与仪器

人结肠癌细胞株SW480购于中国科学院上海细胞库；miR-154 inhibitor、miR-154NC及miR-154引物序列由广州锐博生物公司合成，含双抗的1640培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000、Trizol、逆转录试剂盒购自美国Sigma公司；兔抗人BMI1、β-catenin、Vimentin一抗购自美国Invitrogen公司，鼠抗人β-actin购自碧云天生物技术有限公司；双人水平超净工作台(上海巴玖实业有限公司)；二氧化碳细胞孵育箱(美国Thermo公司)；低温高速离心机(美国Thermo公司)；S1000型PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)；电转仪系统(美国Bio-Rad公司)；DYC-p32型电泳仪(上海巴玖实业有限公司)；转膜仪(南京生兴生物经济技术有限公司)；图像记录分析系统：大连Jim-X Scientific。

1.3 细胞复苏与转染

将冻存的SW480细胞解冻、复苏，接种于含10%胎牛血清和1%双抗的1640培养液，置于37 ℃、5%CO2环境的恒温培养箱中，待其贴壁。取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化细胞，制备单细胞悬液，调整细胞密度为2×105个/ml，接种于6孔板，继续培养24 h，待细胞汇合度达到70%左右时，按照说明书要求，用Lipofectamine2000将miR-154抑制物(miR-154 inhibitor)和阴性对照(miR-154 normal control，miR-154 NC)转染至SW480细胞，Opti-MEM 培养液替换常规培养液，转染8 h后换为常规培养液。

1.4 划痕实验检测细胞迁移能力

将转染后SW480细胞以约5×105个/孔的密度接种于6孔板，于不含FBS的RPMI-1640培养液中饥饿处理12 h；用10 μl的移液枪头垂直于板面划痕，之后每4 h观察一次细胞迁移状态，于倒置荧光显微镜下拍照，用做图软件处理，计算每组细胞24时和0时的划痕宽度之比。

1.5 RT-PCR检测miR-154表达

取冻存的癌组织和癌旁组织于液氮预冷的研钵中研磨成粉末，加1 ml Trizol，按说明书中所示步骤提取总RNA，行逆转录反应。取2 μl RNA进行PCR扩增：内参β-actin引物序列：F:5'-TAGCTAGGGCTTAGCTTGGC-3'，R:5'-TGGGCTAGGGCAAACTGACA-3'，miR-154引物序列：F:5'-CTGGATCGATTCGGCTAAAC-3'，R:5'-TAGGCTAGGCTTAGCTAACG-3'，扩增条件：94 ℃预变性2 min，1个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃总延伸6 min。取5 μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外线投射仪下观察电泳条带，Image Pro Plus 6.0分析目的基因和参比基因的条带灰度值比值。

细胞实验中将各组细胞转染24 h后，取离心并洗涤后的细胞，Trizol提取总RNA，后续步骤同上，检测miR-154基因表达。

1.6 Western Blot检测组织、细胞内BMI1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达

取冻存的癌组织和癌旁组织，RIPA裂解液提取总蛋白，将蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶加样孔进行电泳，使蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶室温封闭2 h，TBST温和洗膜3 min后加入相对应的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤10 min×3次，加入二抗，室温下孵育1 h，TBST洗涤10 min×3次，加入配制好的ECL发光液，避光孵育5 min，化学发光凝胶成像仪中采集图片信息，图片用Image pro plus 6.0软件进行灰度分析。每个实验结果独立重复3次。

细胞实验中将各组细胞转染24 h后，取离心并洗涤后的细胞，后续步骤同上，检测BMI1、E-cadherin、Vimentin蛋白表达。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 癌组织、癌旁组织内miR-154和BMI1的表达

miR-154在癌组织的表达显著低于癌旁组织(t=13.22,P<0.001)，而BMI1在癌组织的表达显著高于癌旁组织(t=10.313,P<0.001)，见图1。

注：A为miR154表达的RT-PCR电泳图；B为BMI1蛋白表达Western Blot电泳图；C为miR154表达的RT-PCR结果分析；D为BMI1蛋白表达Western Blot结果分析。*为与癌旁组织相比，P<0.05。

2.2 miR-154和BMI1在癌组织中的表达与结肠癌患者临床病理特征的相关性

miR-154、BMI1表达与结肠癌患者的性别、年龄无关，与淋巴结转移、TNM分期、分化程度有关，见表1。

表1 miR-154和BMI1表达与结肠癌患者临床病理的相关性

2.3 转染miR-154 inhibitor和miR-154 NC的SW480细胞迁移能力的比较

转染24 h后，miR-154 NC组细胞划痕间宽度与0 h时宽度之比为(0.21±0.03)；miR-154 inhibitor组细胞划痕间宽度与0 h时宽度之比为(0.79±0.08)，显著高于miR-154 NC组(t=12.45,P<0.001)。见图2。

图2 划痕实验检测转染miR-154 inhibitor和miR-154 NC的SW480细胞迁移能力

2.4 转染miR-154 inhibitor和miR-154 NC的SW480细胞内BMI1、E-cadherin和Vimentin蛋白表达比较

转染miR-154 inhibitor的SW480细胞内BMI1和E-cadherin的表达显著高于转染miR-154 NC的细胞(tBMI1=11.311,P<0.001;tE-cadherin=15.341，P<0.001)，而Vimentin的表达显著低于转染miR-154 NC的细胞(t=9.203,P<0.001)。见图3。

3 讨论

结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，靶向药物的发展是改善中晚期结肠癌患者预后的重要方向。miRNA具有表达稳定的性质，对肿瘤的发生、发展有重要调控作用，在恶性肿瘤的诊断、靶向治疗中有重要的应用价值。上皮-间质转化(EMT)在恶性肿瘤的发展中发挥重要作用，是肿瘤细胞获得迁移能力的重要途径[7-8]。miR-154已被证实在多种恶性肿瘤细胞的EMT过程中发挥调控作用。Lin等研究证实[5]，miR-154能靶向ZEB2而抑制非小细胞肺癌的迁移和侵袭；Chen等报道[6]miR-154靶向HMGA2抑制前列腺癌细胞的EMT。同时有研究证实[9]，miR-154通过靶向抑制BMI1的表达而抑制非小细胞肺癌的EMT。以上研究说明，miR-154通常作为抑癌基因在多种肿瘤细胞中发挥作用，但其在结肠癌中发挥的作用尚未见报道。本研究中，我们首先检测了miR-154在结肠癌组织和癌旁组织中的表达，结果显示，miR-154在癌组织中的表达显著低于癌旁组织，同时，miR-154在存在转移、分化程度较低及TNM分期较高的癌组织中都呈现低表达，以上研究结果提示，miR-154在结肠癌中可能也是作为抑癌基因发挥作用。为了验证miR-154对结肠癌细胞的EMT过程是否有影响，我们用载有miR-154-inhibitor和miR-154-NC的质粒分别转染结肠癌细胞，并检测24 h内细胞的迁移能力，结果发现，miR-154-inhibitor组细胞的迁移能力显著高于miR-154 NC组，说明抑制了miR-154表达后，结肠癌细胞的迁移能力随之提升，提示miR-154对结肠癌细胞的EMT过程可能有抑制作用。

注：*为与miR-154 inhibitor组相比，P<0.05。

BMI1是多梳基因抑制复合体1(PRC1)家族成员，多项研究证实，BMI1在结肠癌中呈现高表达，发挥促癌作用[10-11]。上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)是EMT发生过程中2个标志性因子，其中E-cadherin是上皮细胞的标志蛋白，而Vimentin是间质细胞的标志物[12]。有研究证实[13-14]，BMI1能抑制E-cadherin的表达，刺激Vimentin的表达，从而促进肿瘤细胞的EMT。本研究中，我们检测了BMI1在结肠癌组织及癌旁组织中的表达，结果显示BMI1在癌组织中的表达显著高于癌旁组织，这一发现与既往报道相一致[10-11]。有报道称miR-154在肺癌细胞中对BMI1有靶向调控作用[9]，基于这一理论，我们检测了miR-154在结肠癌细胞中能否通过BMI1发挥作用，结果发现，miR-154-inhibitor组SW480细胞中BMI1的表达显著高于miR-154 NC组，与此同时，miR-154-inhibitor组细胞E-cadherin显著高于miR-154 NC组，Vimentin显著低于miR-154 NC组，说明抑制了miR-154的表达后，BMI1的表达被上调，继而刺激E-cadherin的表达，抑制Vimentin的表达，同时，与miR-154表达规律相反，BMI1在存在转移、分化程度较低及TNM分期较高的癌组织中都呈现高表达。以上实验结果提示，在结肠癌细胞中，BMI1可能是miR-154的靶基因，其低表达继而调控EMT相关因子的表达。

综上所述，miR-154在结肠癌中可能作为抑癌基因发挥作用，其机制可能是通过抑制BMI1基因表达，从而调控EMT相关因子水平，最终抑制了肿瘤细胞的EMT过程。