葡萄酒酿造过程中风险因素的分析研究

王 琳，刘 睿，孙德鹏，毕会芳，孙嵛林，胡明燕

（山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101）

近些年来，随着我国经济的发展，居民生活水平的提高，葡萄酒消费量也在逐年增长。消费需求猛增的背后是消费者保健意识的提升。葡萄酒作为一种发酵酒，除气味芳香易入口外，其富含氨基酸、蛋白质、维生素、有机酸等营养成分，尤其是多酚类化合物如白藜芦醇、儿茶酚等具有美容养颜、抗氧化等功效，对于减肥、预防心血管疾病、降血脂等均有促进作用[1]，被越来越多的消费者所认可。

对于食品而言，安全问题依然被放在关注的首位。葡萄酒作为一种食品，近些年来对其安全的关注也越来越多。葡萄酒的安全风险存在于生产的各个环节，原料质量、酿造用水、发酵过程、灌装等都可能给葡萄酒带来潜在的安全风险[2]。本文对葡萄酒的风险因素进行了系统分析，从外源性和内源性两个方面对葡萄酒质量安全的风险因素进行了阐述，主要涉及农药残留、真菌毒素、重金属、食品添加剂等风险点的来源、产生机制、对消费者健康影响及安全限量范围等方面；同时，本文对于涉及到葡萄酒品质安全的风险因素进行了简要说明，以期促进国内葡萄酒消费市场的规范化、健康化发展。

1 葡萄酒质量安全的外源性风险因素

葡萄酒外源性风险是指在葡萄酒生产过程中从外界引入的有害物质造成的危害。这些有害风险物质主要来源于酿造环境、所用原料、生产器材、包装材料等[2]。

1.1 农药残留

葡萄尤其是酿酒葡萄适宜生长在干燥的环境中，湿度较高易诱发病虫害发生。中国的酿酒葡萄栽培区多为季风气候，雨热同期，加重了病虫害的发生。在葡萄园中使用除草剂、杀虫剂和杀菌剂成为果农们广泛使用的病虫害防治方法[3]。栽培过程中农药的滥用会造成酿酒葡萄农药的残留，并最终通过发酵过程转移到葡萄酒中[4]。研究表明，农药残留在人体内长期蓄积滞留会引发慢性中毒，严重危害人体健康[5]。

葡萄中登记使用的农药种类越来越多，为了控制葡萄农药滥用导致农药残留超标，欧盟、美国、中国等均制定了葡萄果实中农药残留的限量标准[6-7]。同时为了进一步同步国标标准，消除葡萄出口障碍，国标GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》对农药残留限量进行了修订，涉及到葡萄的农药残留限量增加到138 项，较2016 年版增加了18 项，基本实现了我国批准登记农药品种限量全覆盖，该标准于2020 年2 月15 日实施[7]。

1.2 真菌毒素

1.2.1 赭曲霉毒素A

真菌毒素是某些真菌生长过程中产生的次级代谢产物，赭曲霉毒素是真菌毒素中具有代表性的一种[8]，由曲霉菌和青霉菌代谢产生，包含7 种结构类似的化合物[9]，其中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是自然界中最常见、已知毒性最强的一种构型[10-11]，国际癌症研究机构将其列为2B 类致癌物[12]。

OTA广泛存在于谷物、水果、饮料、咖啡等各种食品中，对人们的健康造成潜在威胁。1996 年首次在葡萄酒中检出OTA，随后澳大利亚、法国、西班牙等国家也都在葡萄酒中陆续检出[10]。食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）认为葡萄酒是仅次于谷物，能使人感染OTA 的第二大食品[13-15]。目前，我国已成为葡萄酒消费大国，有效控制和解决葡萄及葡萄制品中的OTA 污染，关乎食品安全。为了有效控制葡萄酒中的OTA含量，欧盟、国际葡萄与葡萄酒组织（International Organisation of Vine and Wine，OIV）、保加利亚、意大利、法国均对包括葡萄酒在内的不同类型的产品进行了限量规定[10，16-18]。结合我国葡萄酒中OTA污染及产品消费量情况，对我国葡萄酒中OTA 的暴露风险进行了评估，在国标GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中增加了葡萄酒中赭曲霉毒素A的限量要求为2.0 μg/kg[19]。

1.2.2 展青霉素

展青霉素（Patulin，PAT）是自然界中广泛存在的一种真菌毒素，主要由青霉和曲霉代谢产生[20]。展青霉素在水果及其制品、蔬菜、谷物等均不同程度的被检出到，尤其苹果被证实是进入食物链的主要途径[21-22]。展青霉素是可能致癌物[23]，国际癌症研究中心将其归入第3 类物质，即对人体致癌尚未归类的物质[24-25]。目前国标GB 2761—2017 中仅对于以苹果和山楂为原料的酒类产品中限量要求为50 μg/kg[19]。而有研究表明，葡萄酒中展青霉素阳性检出率也很高，且红葡萄酒比白葡萄酒更容易受到展青霉素污染[26]。

1.3 重金属

重金属元素一般指在标准状况下单质密度大于4500 kg/m3的金属元素，主要有镉、汞、银、铜、金、铁、铅等，其离子形式一般是有毒的。葡萄酒中的重金属离子主要来源于生态环境、农药肥料及酿酒设备。

葡萄种植过程中用于广泛使用的杀菌剂波尔多液是铜离子的主要来源，其次是土壤中的铜离子迁入，铜制酿制设备以及酿制过程中为去除硫化氢等带来的还原味常常添加硫酸铜、柠檬酸铜都会将铜引入葡萄酒[27]。铜离子含量过多会使葡萄酒产生沉淀并影响口感，若人体摄入量过多则会产生毒性，影响肝、肾健康[28]。葡萄酒中的铅主要来自于种植过程中使用的含铅剂及接触到的含铅容器，其毒性较强，会对人体多系统尤其是中枢神经系统造成严重损害[29]。砷的来源主要是使用含砷的农药和环境中砷的污染，元素无毒，但不同价态的化合物具有很强的毒性，在体内蓄积会造成人体多脏器损害且是潜在的致癌物质[29]。镉的污染主要来源于人类活动，如喷洒含镉的农药、离葡萄园近的工厂造成的环境污染及使用含镉的容器接触，其主要积蓄在肾脏，引起人体泌尿系统功能改变[29]。此外，镉过量还会引起组织代谢障碍，有致畸、致癌和致突变的作用[29]。

OIV明确规定葡萄酒中砷、铅、镉、铜的最大浓度限量分别为200 μg/L、150 μg/L、10 μg/L和1 mg/L[30]。我国的国家标准对葡萄酒中重金属元素也有明确规定，GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》规定葡萄酒中的铅的最大浓度限量为0.2 mg/kg[31]。GB 15037—2006《葡萄酒》规定葡萄酒中铜的最大浓度限量为10 mg/L[32]。

1.4 塑化剂

塑化剂又称增塑剂，是一种增加材料柔软性或使材料液化的添加剂，其本质是一类邻苯二甲酸酯类化合物。塑化剂为激素类环境污染物，可干扰人体雌激素的正常调节，严重可致畸致癌[33]。葡萄酒塑化剂的污染一方面是原料富集环境中的邻苯二甲酸酯类物质，另一方面由于酿造或贮存过程中与含有邻苯二甲酸酯类物质的生产器具接触导致的，由于塑化剂在乙醇中有较高的溶解性，酒精度越高的葡萄酒受塑化剂污染的概率越大[33]。

国际癌症研究署和美国环境保护署将邻苯二甲酸酯类化合物列为人类可能的促癌剂和致癌物，美国、欧盟和我国都先后将邻苯二甲酸酯类化合物列为优先控制的污染物。2019年11月3日，国家市场监督管理总局发布《食品中“塑化剂”污染风险防控的指导意见》，意见规定葡萄酒中邻苯二甲酸二（α-乙基己酯）、邻苯二甲酸二异壬酯、邻苯二甲酸二正丁酯最大残留限量分别为1.5 mg/kg、9.0 mg/kg和0.3 mg/kg。

1.5 潜在过敏原

食物过敏是机体对于食物或食物成分的免疫异常反应，严重时甚至导致休克、死亡。超过90%的食物过敏主要是由9 类物质引起的，多为相对分子质量10000～70000的蛋白质或糖蛋白[34]。

葡萄酒中可能存在的易导致过敏反应的主要为两大类物质，一类是作为葡萄酒生产中普遍使用的抗氧化剂和抑菌剂二氧化硫；另一类是葡萄酒下胶过程中使用的蛋清、脱脂奶粉、酪蛋白及鱼胶等蛋白类下胶剂[35]。

对食品过敏原进行严格标注已成为一种发展趋势，某些国家为此专门立法强制执行。国际上主流发达国家对葡萄酒过敏源标识的管理是除了二氧化硫含量超过10 mg/L 必须标注外，若使用了蛋清、脱脂奶粉、酪蛋白及鱼胶等蛋白类下胶剂，必须注明过敏原[35]。国标GB 7718—2011《食品安全国家标准预包装食品标签通则》中对致敏物质为推荐标注内容，除对二氧化硫有强制标注要求外，对其他过敏原信息并未强制要求标注[35]。

1.6 食品添加剂

CAC 定义食品添加剂是有意加入到食品中，在食品的生产、加工、制作、处理、包装、运输和保存过程中具有一定的功能作用，其本身或其副产品成为食品的一部分或影响食品的特性其本身不作为食品消费，无论其是否具有营养价值都不作为传统的食品成分的物质[36]。若长期食用超剂量食品添加剂的食物则会对人体健康造成危害，GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对各类添加剂的使用均有明确规定。

1.6.1 防腐剂

二氧化硫长期以来都是葡萄酒中允许使用的防腐剂，传统认为二氧化硫对葡萄酒具有抗菌和抗氧化作用，此外还有一些辅助作用，如溶解、澄清、增酸等作用[37]。

二氧化硫过多的加入会对葡萄酒自身产生副作用。如具有刺激性的“硫味”影响葡萄酒的风味品质；会影响苹果酸-乳酸发酵；在酒精发酵中二氧化硫与乙醛生成相对稳定的乙醛亚硫酸不利于酒精发酵；与花色素苷结合生成无色的不稳定亚硫酸色素化合物；与酒中其他香味成分结合生成结合态二氧化硫影响葡萄酒质量；增加葡萄酒的耗氧量等降低葡萄酒的品质等[38]。

高剂量的二氧化硫除了会影响葡萄酒的品质外，还会对人体产生不利影响。许多消费者尤其是哮喘病患者都有硫不耐受症和高敏症[28]。为此，世界卫生组织一直要求降低食品中的二氧化硫浓度。美国食品药物管理局和世界卫生组织联合食品添加剂专家委员会制定每天二氧化硫的安全摄入限量是0.7 mg/kg体重[37]。美国食品药品管理局把二氧化硫从美国FDA 评价食品添加剂安全性指标（Generally Recognized as Safe，GRAS 认证）一类中去除，并规定如果产品中游离二氧化硫含量超过10 mg/L，必须在标签上注明二氧化硫的含量[39]。欧盟根据含糖量不同规定，红葡萄酒含糖量小于5 g/L 和大于5 g/L 最高限量分别为150 mg/L 和200 mg/L，白/桃红葡萄酒分别为200 mg/L 和250 mg/L[40]。OIV对葡萄酒中的总硫进行了限量规定，其范围为150～400 mg/L。澳大利亚、新西兰和美国分别规定二氧化硫限量为250～300 mg/L、250～400 mg/L和350 mg/L；中国规定非甜型葡萄酒为250 mg/L，对于甜型葡萄酒或果酒则放宽到400 mg/L[38]。

除二氧化硫外，山梨酸因毒性低，抑菌效果好，在GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》和GB 15037—2006《葡萄酒》中明确规定其限量值为0.2 g/kg[32]。除此之外，GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定在发酵酒中允许使用的防腐剂如纳他霉素、溶菌酶在葡萄酒中均不得使用[41]。实际检验中由于葡萄酒中苯甲酸存在本底值常有少量检出，GB 15037—2006《葡萄酒》中规定苯甲酸限量为50 mg/L[32]。欧盟限量规定葡萄酒中山梨酸含量为200 mg/L，苯甲酸不得使用。

1.6.2 合成着色剂

着色剂又称食品色素，是以食品着色为主要目的，使食品赋予色泽和改善食品色泽的物质。工业生产普遍使用化学合成着色剂，但长期食用将严重危害人体健康。我国允许使用的合成着色剂有主要包括苋菜红、胭脂红、赤藓红、新红、柠檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝等。对于葡萄酒GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中明确规定禁止添加合成着色剂[41]。

1.6.3 甜味剂

甜味剂按照化学结构和性质分为糖类和非糖类，其中糖类物质作为重要的营养素，在中国不作为食品添加剂。非糖类甜味剂按照来源分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。天然甜味剂主要包括甜菊糖、甘草、甘草酸二钠、甘草酸三钾和甘草酸三钠等，人工合成甜味剂主要包括糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、阿力甜等。大量动物实验证实少量食用甜味剂对人体不会产生任何危害，但长期过量摄入也会对身体健康造成一定损害。GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中明确规定葡萄酒中禁用使用任何种类的甜味剂[41]。

2 葡萄酒质量安全的内源性风险因素

葡萄酒的酿造是一个微生物代谢的过程，存在一定的不可控性。发酵过程中可能会产生一些有害的因素，如一些微生物的污染及氨基甲酸乙酯、生物胺、高级醇、甲醇等微生物代谢副产物，如果控制不当超过相应的限量标准要求，可能会危害人体健康。

2.1 微生物

作为发酵食品，微生物在葡萄酒的酿造过程中起着关键作用，葡萄酒的酿造是在一个相对密闭、纯种菌株的发酵环境下进行。但葡萄汁作为一种天然培养基，适宜大多数微生物的生长繁殖，如果环境条件控制不好，可能存在杂菌污染的风险，对于酿造过程甚至于人体健康带来威胁。

根据食品中常见的微生物污染情况，通常的微生物检验项目包括细菌总数、大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、霉菌和酵母菌等[42]。自2005 年10月1日起，GB 2758—2005《发酵酒卫生标准》对葡萄酒中微生物限量进行规定，菌落总数≤50 cfu/mL，大肠菌群≤3 MPN/100 mL，肠道致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌）不得检出[43]。2013 年2 月1 日GB 2758—2012《食 品安全国家标准发酵酒及其配制酒》代替了GB 2758—2005《发酵酒卫生标准》，删掉了菌落总数、大肠菌群和志贺氏菌的限量要求，而沙门氏菌和金黄色葡萄球菌则规定不得检出[44]。2014 年7 月1 日国家卫计委发布GB 29921—2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》删除了对葡萄酒微生物限量要求[45]。欧盟和OIV标准中暂未考虑微生物限量规定[40]。

2.2 微生物代谢物

2.2.1 氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）存在于多数发酵食品中，具有基因毒性和致癌性，主要是由发酵过程中含氮化合物的不完全代谢导致，其前体物质众多，有氰化物、尿素、瓜氨酸、N-氨基甲酰类化合物[46-48]。EC对人类具有潜在的致癌风险，被国际癌症研究署归为2A 类致癌物[49]。国际粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会在第64次会议中规定EC的基准剂量为每天0.3 mg/kg BW，并保守估计如果饮用酒精饮料，每天摄入EC 含量可达80 ng/kg BW，酒精饮料是人体摄入EC 的主要来源[50-51]。

1971年首先在葡萄酒中检出EC，此后世界各国研究人员又在不同发酵饮料中检出了EC。1985年，加拿大卫生与预防部门制定了葡萄酒中的EC限量，佐餐葡萄酒为30 μg/L，加强葡萄酒为100 μg/L[47]。随后美国也对葡萄酒EC 含量进行了规定，佐餐葡萄酒限定为15 μg/L，餐后甜葡萄酒为60 μg/L[52]。2002 年联合国粮农组织制定了国际标准，食品中EC 含量不得超过20 μg/L。2008 年韩国食药局制定葡萄酒中EC 限量标准为30 μg/L。目前中国还未对葡萄酒中EC 含量进行限量规定。但根据Schlatter 和Lutz 计算的“真正安全的剂量”，葡萄酒中EC含量低于10 μg/L是安全的[53]。

2.2.2 生物胺

生物胺是一类低分子量的含氮有机化合物的总称，广泛存在于各类发酵食品中。根据结构可分为3 类：脂肪族（腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等）；芳香族（酪胺、苯乙胺等）；杂环胺（组胺、色胺等）[54]。大量研究表明，葡萄酒中的生物胺的产生主要由几方面因素构成，包括苹果酸-乳酸发酵阶段微生物的作用、原料中氨基酸含量组成及发酵过程中的温度、果皮的浸渍时间及陈酿方式等[55]。

生物胺中以组胺对人体健康影响最大，其次是酪胺。研究者认为，酒精性饮料中组胺的有毒界限为2～10 mg/L，酪胺的有毒界限为10～80 mg/L[56-57]。针对毒性较高的组胺，许多国家已经对葡萄酒中的组胺制定了限量范围。澳大利亚、匈牙利和瑞士不得高于10 mg/L，法国不得高于8 mg/L，荷兰不得高于3.5 mg/L，比利时不得高于5～6 mg/L，德国不得高于2 mg/L[56]，我国尚缺乏相关限量要求。

2.2.3 高级醇

高级醇是3个碳以上的一元醇类物质的总称[58]，是酒类饮料的重要风味物质之一，也是葡萄酒酿造过程的主要副产物。在酒精发酵过程中，高级醇的形成主要来源于降解代谢和合成代谢两条途径。在降解代谢途径中，高级醇由氨基酸形成，包括氨基酸被转氨为α-酮酸，酮酸脱羧成醛，醛被还原成为高级醇[59]。在合成代谢途径中，由糖类提供生物合成氨基酸的碳骨架，在其合成中间阶段形成α-酮酸中间体，由此脱羧和还原就可形成相应的高级醇[59]。

高级醇含量过高或过低会影响葡萄酒的口感。更重要的是高级醇含量过多会对人体有麻醉作用甚至使饮用者中毒[60]。高级醇的毒性随分子量增大而增加，其中以异戊醇和异丁醇毒性较大[59]。异戊醇含量过高会使人恶心、头痛；异丁醇含量过高会对人眼睛、鼻子产生刺激[61]。研究证明高级醇对人体的肝脏有毒害作用，若酒中高级醇含量超过3000 mg/L则不能饮用[62]。

2.2.4 甲醇

葡萄酒中的甲醇主要是由于原料中果胶物质水解、氨基酸脱氨和发酵原料霉变，或是生产过程中浸渍发酵时间过长产生，发酵过程中添加果胶酶也会增加甲醇的产生量[63]。因为白葡萄酒是用果汁进行发酵，所以白葡萄酒中甲醇含量一般比红葡萄酒的低。甲醇含量超标会影响视觉神经，重度中毒甚至会导致失明，所以在酿造过程中对甲醇含量要严格控制[64]。GB 15037—2006《葡萄酒》中对葡萄酒甲醇含量进行了明确规定，红葡萄酒≤400 mg/L，白葡萄酒≤250 mg/L[32]。

3 葡萄酒品质安全的风险因素

葡萄酒作为一种特殊的食品，在满足安全性要求的基础上，品质是决定葡萄酒质量的重要因素[2]。品牌、生产工艺、产地、年份等信息对消费者的购买倾向往往起决定性作用。但为了追求利益最大化，简化生产工艺，随意更改产地、年份等信息的行为使葡萄酒的品质安全受到威胁，既损害了消费者利益，又扰乱了葡萄酒市场的公平竞争[65]。

葡萄酒的品质指标包括酒精度、总糖、干浸出物等，其含量高低虽不会对人体健康造成影响，但对葡萄酒的产品类型及质量等级的划分起重要作用。工艺控制不严、检测手段不到位均可能导致品质指标出现问题，甚至是企业蓄意造假，因此需要加强对企业的管理与控制。

有机酸作为葡萄酒的主要呈味物质之一，决定了葡萄酒的酸度，与葡萄酒品质的优劣有很大关系。有些掺假葡萄酒中会人为添加柠檬酸或其他酸以弥补葡萄汁中酸度的不足，最终导致柠檬酸超过国家标准要求。甘油是酵母酒精发酵的副产物，具有甜味并产生圆润的口感，可增加挂壁效果。一些葡萄酒生产企业为了改善葡萄酒的口感、提高干浸出物含量、增强葡萄酒的挂壁效果，在葡萄酒中人为添加甘油[66]。采用高效液相色谱的方法对有机酸和甘油的含量进行测定，可以对掺伪葡萄酒进行初步判断。

在GB 15037—2006《葡萄酒》中虽然规定了产地、年份、品种葡萄酒的定义，但却没有制定相应的鉴别方法标准，造成标准真空，给一些不法分子以可趁之机，从而造成葡萄酒产地、年份、品种等造假现象屡禁不止。

传统的检测技术虽然可以准确的测定葡萄酒中的各个指标，但却无法对葡萄酒在产地、年份及品种等的真伪方面进行鉴别。因此我国针对葡萄酒此类属性的真伪鉴别开展了较为集中的技术研究，形成了一些鉴别方法。如采用矿质元素分析、成分分析和稳定同位素分析可以实现原料品种、产地真实性的鉴别，同时采用稳定同位素技术通过对δ18O 和δ13C 的测定鉴别葡萄酒有无掺杂外源性水、乙醇和糖等[67]。

对于葡萄酒产品真实性问题的控制，除了通过建立一套行之有效的产品溯源和质量保证体系外，最关键的手段则是尽快出台一系列能够有效鉴别酒精来源、产地、年份信息的检测方法标准，配合政府部门的强力监管，从而对不法分子造成有效震慑，保障合法企业和消费者的利益[65]。

4 小结

从外源性和内源性两个方面出发，对葡萄酒质量安全的风险因素进行了系统分析，并对风险因素的来源、产生机制、对消费者健康影响及安全限量范围进行了详细的阐述；同时，从品质安全角度出发，对影响葡萄酒品质的风险因素进行了分析。通过对葡萄酒安全风险因素的全面分析，一方面可以帮助生产企业把控生产过程，同时对相关部门安全指标的制定和完善及加强对葡萄酒的监管起促进作用，从而利于葡萄酒行业的健康发展。