家畜胚胎克隆关键技术及应用研究

宋雪莹，佟桂芝，宋 斌，李 平，刘德会，李玉龙，丁丽艳，李同豹

（黑龙江省农业科学院 畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 160000）

胚胎克隆是指将供体细胞核转移至去核受体细胞中，获得重构胚胎的过程。核移植技术根据供体和受体细胞的来源，分为胚胎移植和体细胞核移植；根据是否在同一物种间进行，分为同种间核移植和异种间核移植。1938年，H.Spemann等［1］为证明分化细胞是否具有全能性，将胚胎细胞的细胞核移植到无核的卵母细胞中，但由于技术手段不够成熟并没有成功。这也是关于胚胎核移植技术的最早期研究。1999年，A.Baguisi等［2］将绵羊卵母细胞去核，只留下细胞质，再将体细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞中，并在灭活病毒或电刺激下介导二者融合，最后将发育到囊胚期的重构胚移植到受体雌性动物子宫中，得到了3只克隆绵羊，这标志着世界上第一例利用体细胞核移植克隆哺乳动物的诞生。2008年，C.S.Rogers等［3］通过基因打靶和SCNT结合成功获得第一个疾病模型克隆猪。异种间核移植是指核供体细胞和核受体细胞来源于不同物种之间。目前，异种间核移植在鱼类属间和哺乳动物种间成功应用。

1 胚胎克隆关键技术

1.1 核供体细胞的选择

目前，可用作供体的细胞包括乳腺细胞、胎儿的细胞、胚胎细胞［4］、卵丘细胞［5］、成纤维细胞［6］、成年公鼠尾尖细胞［7］、睾丸支持细胞［8］、胚胎干细胞、神经干细胞、肌肉细胞［9］。研究发现，将卵丘细胞作为供体核，胚胎囊胚率最高。E.Lee等［10］将成年猪成纤维和胎儿成纤维细胞作为供体核，发现胎儿成纤维细胞作为供体核获得的克隆胚胎发育更好。除此之外，干细胞作为供体核在转基因动物生产过程中由于基因打靶效率高、表达稳定等优点，成为动物克隆胚胎首选的细胞，但胚胎干细胞分裂较为困难［11］。目前小鼠成为较成熟的分离出干细胞的试验动物。综上，作为供体的细胞分化程度越低，重构胚胎的细胞核编码能力就越强，成活率越高。

作为核供体一般选择G0／G1期细胞，在重新构建胚胎时较稳定，易获得成活率较高的个体。常用营养饥饿法、低温处理法和DNA合成阻断法进行诱导。

1.2 受体卵母细胞的选择

受体卵母细胞的选择直接关系着重构胚胎的发育，其中卵母细胞来源是主要影响因素之一，一般选择经产雌性动物，其体内有成熟的卵母细胞。一般选择MⅡ期卵母细胞，该时期的细胞成熟促进因子具有较强活性。选择健康状况良好、无畸形、发情规律、2～4胎、发情时间在克隆胚胎激活之后0～36 h的经产母猪作为胚胎移植受体［12］。

1.3 受体卵母细胞去核

受体卵母细胞的去核是细胞克隆的关键技术之一。目的是去除受体细胞原来的核遗传物质，以表达重构胚胎的遗传物质。如去核不完全可导致重构胚胎染色体异常、发育受阻甚至死胎；如去核过多，则会影响核移植后有效的细胞核重新编程。

受体卵母细胞的常用去核方法包括以下几种：1）盲吸去核法。指以第一极体（PB1）为参考，利用去核针吸取其附近20%左右的胞质去除细胞核。该方法由于操作简单方便，是现在大多数实验室在体细胞核移植中普遍采用的。但由于物种间的差异或卵龄状况的不同，PB1与细胞核的相对位置可能会存在改变，因此，该方法去核可能会不彻底，从而影响克隆效率。

2）荧光染料法。此法是利用荧光染料与细胞核DNA嵌合后，在紫外灯下去除可见的细胞核。此法位置准确，细胞核去除效率高；但紫外灯长时间照射易损伤受体细胞，对操作者试验操作能力要求较高。

3）化学诱导去核法。是指通过脱羧秋水仙碱处理细胞导致核质均进入第二极体（PB2）以去除细胞核。此法操作简便，避免了人为操作的不稳定性和低重复性，是一种较为有效的去核方法。

4）末期去核法。指直接去除PB2及其下方的少量胞质以达到去核的目的。该方法操作简单，去核成功率高；但卵母细胞必须是成熟、质量好且被激活的。

5）徒手切割法。此法是将去除透明带的卵母细胞在荧光镜下选择没有核物质的半卵，与供体细胞融合后再与另外一个无核物质的半卵融合，以获得重构细胞核。该方法在体细胞克隆牛、小鼠、猪等动物中得到普遍应用。

1.4 重构胚胎的融合和激活

重构胚胎的融合和激活是关系子代出生率和成活率的关键步骤，如出现问题则会阻滞胚胎后期发育。

电融合法指在直流脉冲刺激下，将供核细胞核注入受体细胞的透明带和卵胞质膜之间，重新构建胚胎并完成重新编程，进而获得发育能力。

重构胚胎的激活包括物理激活和化学激活。物理激活指机械刺激、温度变化激活和电激活，其中电激活方法应用较为广泛。电激活是利用细胞在短暂高压直流电脉冲的作用下，细胞膜内外的离子和大分子物质发生短暂且快速的流动，导致钙离子内流而激活细胞。电激活可以一次激活，也可二次激活，具体根据不同细胞特点而确定。化学激活的主要原理是，精子与卵母细胞结合时在特定化学试剂刺激下，膜受体信号系统活化，导致细胞内质网储存的钙离子释放，由于膜内外pH值变化引起钙离子内流，从而激活细胞。目前发现的化学试剂包括乙醇［13］和离子霉素［14］。

选择适宜的激活时机可促进重构胚胎的发育。在供体细胞核融合前激活去核卵母细胞，此时核供体处于哪个时期不影响重构胚胎发育，其基因组的倍性也正常，这种卵母细胞被称为“万能受体”。但使用G1期的供体细胞核，加上融合前激活并去核的卵母细胞可以优化着床前胚胎的发育状态。受体母畜的发情时间也会影响重构胚胎发育。L.Martin等［15］研究发现，猪体细胞克隆胚胎发育速度比体内受精胚胎慢。因此，在克隆胚胎移植时通常建议选择发情时间晚于克隆胚胎激活时间的母猪作为受体。

1.5 重构克隆胚胎的移植

克隆胚胎应尽早移植到受体内，以提高受胎率，也可移植桑葚胚和囊胚阶段的胚胎；可通过手术法和非手术法进行移植，非手术法是利用特定移植设备将胚胎移植到受体特定部位，着床发育。受体应做好同期发情，以使卵巢黄体发育达标。其中不同物种胚胎移植阶段也有较大差异，一般小鼠、牛、羊等在囊胚期移植到子宫角，猪在2、4细胞阶段移植到输卵管内。

2 克隆胚胎技术在牛、羊、猪生产中的应用

牛和羊胚胎克隆的主要目的是利用转基因技术将重新构建的细胞核移植入受体细胞中，以提高牛和羊抗病能力及生产性能为目的。1987年，R.S.Prather等［16］将牛的胚胎细胞核移植到去核的受精卵中，成功获得了首例胚胎克隆牛，1996年我国第一头胚胎克隆牛诞生［17］。克隆胚胎技术在牛上的应用经历了很长的一段研究过程，存在克隆胚胎囊胚发育率低、妊娠率低、出生牛犊成活率低等特点。M.Urakawa等［18］将早期G2期胎儿成纤维细胞的细胞核转移至经过阻滞剂处理和振荡回收的有丝分裂期去核细胞中，将获得的10枚克隆胚胎移植给10头受体母牛，结果受体母牛全部妊娠，并有9头母牛成功产下牛犊。

1991年，张涌等［19］成功获得了世界第一例胚胎克隆山羊。1995年，成勇等［20］首次获得了4只第二代胚胎克隆山羊。

猪在生理结构和解剖结构上都与人类有着高度的相似性，因此研究猪体细胞克隆可为人类探究疾病提供模型。除此之外，猪克隆胚胎的研究对于改良猪品种以获得优质生产性能也具有重要意义。但猪胚胎体外显微操作难度较大，克隆胚胎技术难度高于牛和羊。I.A.Polejaeva等［21］以体内成熟的卵母细胞为受体胞质、颗粒细胞为供体，借助电融合技术构建重构胚，再以其形成的原核作为核供体进行二次核移植，成功获得了第一例体细胞克隆猪。A.Onishi等［22］利用物理激活方法，猪成纤维细胞在电刺激下细胞膜发生改变，将其细胞核物质直接注射到体内成熟的去核卵母细胞内，获得了核移植仔猪。刘忠华等［23］利用体外培养成熟的卵母细胞作为受体卵母细胞，成功获得了体细胞克隆猪。

3 胚胎克隆移植面临的问题和困难

3.1 克隆效率较低

造成动物克隆胚胎效率较低的原因有以下几点：胚胎体外培养和体外操作过程出现问题；外源基因重组时插入整合出现偏差；重组胚胎融合激活时不彻底、不稳定；受体去核不完全，导致重构胚胎重编程不完全。

供体细胞核的不完全重编程将影响克隆胚胎移植效率。克隆胚胎重新编程开始于重组胚胎细胞核膜的破裂，一般在克隆胚胎移植后30 min内发生，如核膜破裂失败则不能发生重编程。随后，体细胞染色质凝集，重构胚胎分化发育［24］。有研究表明，选择分化程度较低的体细胞可提高克隆效率。

3.2 克隆胚胎的安全性

利用克隆胚胎获得的动物及其制品属于转基因产品。目前，世界上对于转基因产品安全性还存在争议。主要原因有以下几点：克隆动物健康指标（包括生长、发育、解剖、生殖功能及生理生化指标）是否能够得到保障；食用克隆动物产品是否会引发过敏反应、是否有毒副作用。可以通过制订相应的标识管理制度评价克隆动物及其产品的安全性。加拿大、阿根廷、中国香港、南非和菲律宾采取自愿标识方法，而美国则采取强制标识。我国采取定性标识的强制标识。在2015年新修订的《食品安全法》将转基因食品生产和销售转基因食品上是否显著标示列入条例［25］。

4 展望

在畜牧业实际生产中，利用克隆胚胎技术可筛选获得性状优良的畜禽，如导入特定基因提高猪肉生产效率、改善猪肉品质。在医学上，哺乳动物的脑结构、功能活动与人类具有较高的相似性，开展克隆胚胎研究可为人类疾病机理和治疗提供动物模型，如利用移植基因修饰技术，构建生产囊状器官纤维化病的克隆猪，用于研究人类的囊状器官纤维化疾病。同时，可利用特定动物生产特异药品，如利用克隆动物技术和转基因技术构建复制乳腺特异性表达的转基因动物个体，并从其乳汁中获得人用蛋白。