对虾肝胰腺微孢子虫病与虾肝肠胞虫关系的研究进展

彭张明，陈妃业，蒲桂川

（1.海南海壹水产种苗有限公司，海南 海口 571126；2.湛江海壹水产种苗有限公司，广东 湛江 524025）

微孢子虫Microsporidia 是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫，目前被认为是真菌的姐妹群（sister group）[1]。自19 世纪第一次在家蚕中发现微孢子虫Nosema bombycis 以来，到目前为止,其仍然是导致养蚕业巨大经济损失的致命性微粒子病的主要病原[2，3]。在养殖泰国黑虎虾（又称斑节对虾）Penaeus monodon 和凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 中先后报道了两种对虾微孢子虫感染病例，分别是对虾八孢虫Agmasoma penaei 和虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。对虾八孢虫主要感染结缔组织和肌肉，使肌肉纤维退化衰退，使对虾通体呈乳白色，而EHP 主要寄生在对虾的肝胰腺组织中[4-7]。近年来，其他八个种对虾微孢子虫也在对虾养殖中被发现[8-15]。王元等[16]在国内首次报道了一种微孢子虫感染脊尾白虾Exopalaemon carinicauda 的临床症状，分析了该病原的形态结构、寄生部位以及造成的病理变化。随着该疾病的流行与传播，自2009 年以来亚洲主要对虾养殖区域（如泰国、中国、印度、越南、印度尼西亚和马来西亚等）均有报道，2017 年委内瑞拉也报道了该疾病，现已对全球对虾养殖产业构成了威胁，使全世界的对虾养殖业受到巨大损失[5,17-19]。

本文概述与分析了EHP 与HPM 的发生与流行、临床体征与病理特征、致病机理、诊断方法及防控措施等，以期为进一步研究HPM 和其他虾类疾病提供参考。

1 发生与流行

1.1 对虾HPM 的发现与传播

Pasharawipas 等[20]于1994 年首次报道印度Chennai（金奈）地区斑节对虾的结缔组织和肌肉感染了对虾八孢虫，随后Lightner[21]也报道了美国佛罗里达州对虾八孢虫对肌肉组织的感染。2009 年和2013 年，Tourtip 等[6]和Tangprasittipap[5]分别报道了EHP 感染泰国地区的斑节对虾和凡纳滨对虾的研究。随后，同样的微孢子虫感染问题波及到了亚洲许多国家。在泰国研究发现，对虾八孢虫不能通过孢子或同类相食在养虾池中水平传播，因此可采取将孵化池、养殖池中的鱼类等疑似宿主彻底清除的控制策略，大幅降低“棉花虾”的流行率[22，23]。而EHP可以通过孢子和嗜食同类进行水平传播[5,24]，即便是养殖池塘中对虾粪便中释放的孢子，也是可以让对虾感染EHP，因此要彻底清除孢子需要花费大量时间和昂贵代价，控制EHP 更加困难，所以，EHP是目前引起HPM 最重要的病原，EHP 的发生和流行已成为全球对虾养殖业中高度重视和亟待解决的问题。

1.2 对虾HPM 的流行与危害

病原传播是水产养殖面临的主要问题，例如在泰国，EHP 引起的HPM 已经成为继白斑病（white spot disease，WSD）和急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）后影响泰国对虾养殖的第三个最棘手的问题[25]。在亚洲和南美洲的一些国家，对虾养殖为国民收入做出了重要贡献，对虾养殖业快速发展促进了亚洲当地经济繁荣，每年的出口收入达数十亿美元，然而在印度，2018 年对虾微孢子虫（EHP）在对虾养殖中的流行，对虾减产10%～20%[26,27]。中国自2013 年首次发现EHP 以来，主要的对虾养殖区域先后都发现HPM的流行，中国渔业报[28]报道浙江省2015 年上半年凡纳滨对虾虾苗EHP 携带率为23.1%。王博雅等[29]抽样分析得到，2015 年辽宁省26 个凡纳滨对虾病样中EHP 检出率为34.6%。陈禄芝等[30]调查发现，2016 年粤西地区对虾样品的EHP 检出率为41.38%，从2017 年湛江市的EHP 流行情况来看，随机抽取的虾样品EHP 阳性率也达到了30%[31]。申红旗等[32]调查发现：2017 年河北省南美白对虾EHP 引起HPM 的发病率为3.58%，实际发病率应高于书面调查数据。2015—2017 年许杰等[33]在天津市采集养殖对虾及饵料生物样品中EHP 的阳性率依次为56.96%、69.52%和29.28%，可见2017 年天津市EHP流行率呈显著下降趋势。2015—2016 年，江苏如东地区大面积养殖的对虾出现严重滞长现象，致使该地区凡纳滨对虾减产15%～30%。抽样检测发现：滞长虾EHP 的小亚基（small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因几乎全部阳性[34]。

2 临床体征与病理特征

2.1 感染EHP 的对虾HPM 临床体征

对虾感染EHP 导致HPM 后一般不会引起对虾死亡，可正常摄食，肠胃充满食物，与正常对虾几乎没有区别，但是，生长明显缓慢，规格差异显著，饲料系数升高[35]，严重时肠道发炎，肝胰腺萎缩、发软，行动迟缓，个别虾还有白便现象[36]。实验结果显示，感染EHP 的5 日龄凡纳滨对虾苗，肝胰腺开始变色；30 日龄后，虾苗生长迟缓，个别发现白便现象。需说明的是，虾苗的饲料颜色与肝胰腺的颜色变化有关，因此，在虾苗未被证实感染EHP 之前，通过观察虾苗肝胰腺颜色变化来判断虾苗是否感染EHP 没有意义[36]。EHP 感染还将导致对虾变瘦，重量降低，这也直接影响对虾养殖产量[37]。

2.2 感染EHP 的对虾HPM 病理特征

对虾HPM 的组织病理表明：在肝胰腺中可见早期孢原质（early sporogonal plasmodia）、后期孢殖团（late plasmodium）和成熟孢子（mature spores）等[6,36]。取对虾肝胰腺进行荧光原位杂交试验（fluorescent in situ hybridization，FISH），在电子显微镜下可观察组织病理与EHP 不同的孢子发育阶段[24]。凡纳滨对虾感染EHP 后，肝胰腺小管上皮细胞中存在明显杂交信号[17]。施惠等[38]剖检EHP 感染的凡纳滨对虾组织，发现鳃和肌肉未见明显病理变化，而肝胰腺出现明显病理体征，如可观察到大量（1.3±0.2）μm×（0.8±0.2）μm 的EHP 孢子颗粒；肝胰腺腔体变小或消失，细胞肿大，肝胰腺上皮细胞肿大，细胞核坏死、消失；肝胰腺上皮细胞出现局灶性坏死或脱落，细胞中存在不同阶段的EHP 孢子。赵若恒等[39]采用差速离心和密度梯度离心方法，从感染虾肝肠胞虫对虾的肝胰腺中纯化出了孢子，用透射电镜、荧光桃红染色观察、血球计数板计数纯化出的孢子。电镜观察表明：孢子为大小在0.7～1.2 μm 的椭圆形。蔗糖密度梯度离心等方法研究发现，江苏如东地区对虾EHP 孢子大小约为1.7 μm×0.9 μm，外壁上有大量白色瘤状物，疑似胞壁蛋白，孢子表面布满细小褶皱，孢子具有一个细胞核，极丝4～6 圈，细胞壁由一薄的电子透亮的孢子内壁和电子致密的孢子外壁组成[34]。这些研究直接说明了EHP 存在的巨大危害性，而对虾八孢虫、匹里虫Pleistophora 和微粒子虫Nosema 等在对虾养殖中鲜有报道，间接表明这些种类不是导致对虾HPM 主要的致病原。

3 致病机理

3.1 EHP 的传播途径及侵染机制

共生及饲喂实验证明，EHP 可通过养殖水体传播，以及摄食寄生EHP 的鲜活饵料、病虾、死虾而感染，即所谓的水平传播[5,24]。丁慧昕等[40]初步证明：EHP 一旦在养殖水环境中存在，即可通过流水分布于养殖环境中，还可以在其他水生生物体内存活，健康虾可以通过摄食寄生EHP 的病死虾或养殖水环境中的孢子体而感染。而对EHP 垂直传播，即通过亲虾传播给子代，目前暂未见报道。EHP 是一种专性、细胞内的寄生虫，其侵染细胞时需要一系列合适的条件。普遍认为，在感染第一步，EHP 孢子壁上的蛋白与宿主细胞的糖胺聚糖相互作用，然后在适合的条件下，极管通过挤压穿透宿主细胞膜。该过程2 ms 内就能完成，最后极管作为导管将具感染性的孢子体转移到宿主细胞中，进入寄生细胞内阶段[41-43]。测定发现，感染EHP 的凡纳滨对虾血淋巴中总蛋白、白蛋白含量、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶活性等生化参数均显著高于正常虾[44]。

3.2 EHP 的增殖与致病

对虾肝胰腺为EHP 提供了最适宜的寄生增殖条件，与其胞内寄生生活相适应。EHP 在进化过程中失去了合成ATP（糖酵解）的功能，而该功能是真核生物产生ATP 的基本通路之一，因此，EHP 只能直接从宿主细胞获得能量，维持其生长繁殖、能量代谢，从而影响宿主的能量代谢[45]。刘珍等[46]用实时荧光定量PCR（qPCR）研究发现，当对虾肝胰腺中EHP SSU rRNA 的相对拷贝数在103copies/（ng Hp DNA）数量级或EHP 载量指数在3 以上时，表现出EHP 较高的风险水平，且对虾EHP 的载量指数与对虾生长速率呈负相关，但在较低的差异范围内，EHP 载量与对虾生长的相关性不明显。程东远[47]用实时荧光定量PCR 检测已感染EHP 对虾不同组织中EHP 的含量，结果显示：肝胰腺＞中肠＞血淋巴＞鳃＞肌肉。原位杂交得到：EHP 主要感染肝胰腺，其他组织中EHP 含量较低。徐胜威等[48]用荧光定量PCR 技术分析得到，氨氮在一定浓度范围内可以有效控制EHP 的携带量。养殖水体氨氮浓度为6.0～9.0 mg/L 时，可以有效减少凡纳滨对虾EHP 的携带量，为凡纳滨对虾的养殖提供了一个重要的指导方向。从以上可知，EHP 导致对虾HPM 的致病能力非常强，当虾体中EHP 的含量超过一定数值后，对虾的危害不言而喻。鉴于此，未来针对EHP 建立的细胞感染模型将会成为探究EHP 致病机理的重要方向，进而得到有效避免EHP 传播和感染的方法和措施。

4 诊断方法

4.1 EHP 检测方法的发展

对虾感染EHP 引起的HPM 没有明显或特定的临床症状，加之又恰逢2006 年亚洲地区AHPND 的大规模爆发，导致EHP 感染早期阶段没有引起足够的重视，在全球的斑节对虾和凡纳滨对虾养殖中广泛传播，对虾生长缓慢的问题越来越普遍，经济损失越来越严重，直接或间接地威胁着整个对虾养殖业的发展[49,50]。随着人们对EHP 的认识不断深入，其诊断方法也迅速发展，出现了一大批EHP 的诊断技术与检测方法，极大地促进了EHP 防控技术和生物安保理念的发展。EHP 的诊断方法主要包括两大类，一类是无法进行定量情况下，只能定性描述病原微生物，例如组织病理和细胞病理学观察、常规PCR 分析、套式PCR（nested PCR）、环介导等温扩增（LAMP）和地高辛标记核酸探针原位杂交等[5,50-52]；另一类EHP 的定量检测，主要是实时荧光定量PCR，包括SYBR GreenⅠ荧光染料qPCR 和TaqMan探针qPCR[53,54]。

4.2 病原的诊断方法

4.2.1 染色镜检法

EHP 的定性诊断方法中，组织病理和细胞病理观察需要借助光学或电子显微镜。EHP 属于胞内寄生，其大小约为0.75～1.0 μm，个体非常小，病理观察时通常借助组织切片[50]。电镜下，可在肝胰腺上皮细胞中发现从早期孢原质到成熟孢子的不同发育阶段的EHP[24]。常晓晴等[55]用8 种染色方法观察了感染EHP 的凡纳滨对虾肝胰腺的组织病理切片。结果显示：Masson 染色法对组织细胞结构染色效果较好，检出率也最高，非常适用于组织内EHP 孢子的染色观察。

4.2.2 现代分子生物学检测工具

目前所使用的分子工具，包括常规PCR、套式PCR、LAMP 及原位杂交对EHP 的诊断，都是通过核酸以SSU rRNA 基因的序列为目的基因来确定[50-52]，但是，与海洋生物中密切相关的微孢子虫SSU rRNA 序列可能会对EHP 产生假阳性，例如寄生在鱼和卤虫中的某些微孢子虫，若以此鱼和卤虫作为虾饲料时，SSU-PCR 方法就有可能导致抽样该饲料及亲虾粪便进行PCR 检测时出现EHP 假阳性的结果，造成一些不必要损失[52]。基于此，推荐利用基于EHP 的孢壁蛋白（EhSWP1）基因序列建立的一种更为特异的套式PCR 检测方法，称为SWP-PCR，其在PCR 第一步反应中比SSU-PCR 更敏感，总体上更具辨别力[52]。叶健等[56]采集不同样本通过3 种PCR 方法检测EHP，结果表明18S-PCR 在第一步扩增的灵敏度最好，SSU-PCR在第二步扩增的灵敏度显著高于SWP-PCR，但存在着一定的假阳性现象，建议检测凡纳滨对虾苗种的虾肝肠胞虫时，宜采用灵敏度更高的套式。除此之外，基于EHP 的孢壁蛋白，运用免疫电镜（Immunoelectron analysis，IEM）进行亚细胞定位，也可以准确定位EHP 的存在[57]。

4.3 EHP 的定量检测方法

4.3.1 荧光定量PCR（qPCR）检测方法

EHP 的定量检测诊断中，SYBR GreenⅠ荧光染料qPCR 和TaqMan 探针qPCR 的引物设计也是基于EHP SSU rRNA，并以含有一定量的EHP SSU rRNA 靶片段的重组质粒DNA 为标准模板[46,53]。实际应用中，TaqMan 探针法具有更高的检测特异性，但是，检测费用高。SYBR GreenⅠ荧光法的检测成本低且操作简单，因此，更加广泛地应用于快速检测，但SYBR GreenⅠ荧光染料qPCR 缺乏特异性荧光探针，可能产生引物二聚体和非特异性扩增产物的干扰，影响结果的准确性，甚至产生假阳性结果[53]。TaqMan 探针qPCR 相比SYBR GreenⅠ拥有更高的敏感性和特异性，一次反应最低，检测病原含量灵敏度可以达到4×101copies，在国际兽疫局（OIE）对水生动物对虾病原体诊断标准中，该法经常作为12 种病原体定量检测的标准方法[53,58]。

4.3.2 国内EHP 定量检测方法建立

国内开展了众多EHP 定量检测研究，报道了所建立方法的稳定性、重复性、敏感性及应用情况[54,59,60]，张娜等[61]针对EHP 18S 相关保守序列设计了1 对特异性引物，优化并建立了EHP 的Taqman 荧光PCR 检测方法，所建方法重复性较好，在模板浓度为6.5×102copies/μL DNA 时，仍有较强荧光信号，较普通PCR 方法检测灵敏度至少高出1 个数量级；黄纪徽等[62]采用一种新型的等温核酸扩增技术——重组酶介导扩增（recombinase-aid amplification，RAA）技术检测EHP，基于EHPSSUrDNA 序列，建立快速检测EHP 的RAA 恒温荧光检测方法，RAA 进行到24 个循环反应时可以检测最小浓度10 copies/μL 的质粒，相当于10 个病毒粒子。

鉴于目前养殖对虾的肝胰腺组织中未报道被EHP 以外的微孢子虫感染，因此，针对对虾肝胰腺组织的EHP 检测，基于SSU rRNA 基因序列的相关SSU-PCR 检测仍然是可信的方法，但是检测粪便、饵料生物、饲料以及环境中潜在的EHP 时，推荐使用SWP-PCR[52]。

5 防控措施

5.1 切断EHP 易感途径

目前还没有确定的药物可以治疗感染EHP 导致HPM 的对虾，因此首要措施是预防。在对虾养殖过程中要认真检查重要的易感环节，首先是种源，对亲虾和苗种进行EHP 检测；其次是投喂饲料，控制饵料投喂，监测养殖水体的EHP；最后是关注行业对虾的疫情检测等，通过以上措施来控制EHP 的传播和感染。具体来说，推荐按照最佳管理措施（best management practices，BMPs）开展对虾种苗繁育与养殖工作[63]。例如育苗前用pH1 左右的盐酸溶液或pH＞11 的碱性溶液消毒所有育苗工具，晾晒干燥5d 以上，全力保证所培育的虾苗为无特定病原（specific pathogen free，SPF）的苗种；高位养殖池塘用高浓度有效氯或高锰酸钾溶液彻底消毒，一般的土池塘底要用生石灰充分消毒和晾晒；PCR 检测虾苗确保不携带有EHP 病原；尽量避免投喂鲜活饵料，可将鲜活饵料置于-20℃以下冰冻或者巴氏灭菌法处理后再投喂。

5.2 严格把好苗种质量关

对虾苗种行业更需要重视虾苗培育过程中的EHP 防控。在高密度工厂化育苗过程中，虾苗感染EHP 的几率和风险远远大于低密度的成虾养殖。已发现的各种致病微生物感染虾，早期虾苗比养殖中晚期更易被感染，且被EHP 感染的虾苗极具威胁性，养殖成功率下降。因此，选择虾苗的首要标准是未携带EHP 病原的虾苗。对检测确诊感染了EHP的虾苗，应在育苗场进行无公害化处理，严禁虾苗流入市场。

6 总结与展望

在对虾养殖过程中，隔离病原体是一种有效控制病原传播的方法，但它需要对受感染的动物进行早期鉴定，快速诊断，用适当的抗生素或控制致病病原体以减轻损失[64]。而EHP 作为一种专性细胞内寄生虫，是对虾HPM 最重要的致病原，对虾一旦感染了EHP 目前还没有有效药物能够治疗，从养殖的各个环节预防EHP 的感染和传播是重中之重。鉴于此，对虾育苗企业需要义不容辞地对虾苗EHP 的生物安全担当与负责，坚持企业初心，为行业提供优质虾苗、良心虾苗。为更准确、快捷诊断环境中EHP的存在，降低因SSU-PCR 检测存在的假阳性，期待早日开发出基于EHP 孢壁蛋白（EhSWP1）基因序列的实时荧光定量PCR 的检测方法，为预防EHP的传播提供准确方向，期待借助EHP 侵染宿主的机制开发出预防及治疗EHP 的方法。