植物WRKY 转录因子家族基因研究进展

卜华虎，王晓清，任志强，肖建红，张 宁，杨慧珍

（1.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原030031；2.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；3.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031）

WRKY 是一类存在于高等植物中的重要调控因子。1994 年ISHIGURE 等[1]从甘薯中发现第1 个WRKY 基因家族成员SPF1，并发现其受蔗糖和PGA 诱导表达。随着研究的深入，已经在多种植物基因组中克隆和鉴定出WRKY 类基因，其中，拟南芥74 个[2]、水稻109 个[3]、大豆182 个[4]、杨树104 个[5]、短柄草86 个[6]、黄瓜55 个[7]、玉米136 个[8]。诸多研究表明，WRKY 基因参与植物生长发育进程以及植物对逆境胁迫的响应。

植物在长期进化过程中形成了复杂的调控网络，参与植物生长发育和逆境响应，转录因子家族在该过程中起到重要作用。目前，拟南芥和水稻基因组含有超过2 000 个转录因子家族。其中，WRKY基因家族在参与植物抗逆响应中起到重要作用，参与植物对干旱、盐害、高温冷害、缺素、病虫害等多种环境胁迫的响应[9]。

1 植物WRKY 转录因子结构特征

WRKY 转录因子家族成员均含有60 个氨基酸残基序列组成的高度保守结构域，称为WRKY 结构域，其N-端含WRKYGQK 保守序列[10]，与DNA结合活性相关[11]；其C-端具有一个典型的锌指结构，一般由CX4-7CX22-23HXH/C 组成，参与蛋白质互作和辅助DNA 结合的作用。WRKY 蛋白还含有细胞核定位信号肽（NLS），参与对靶基因的调控作用；某些WRKY 蛋白还具有亮氨酸拉链（leucine zipper）结构域，能够增强转录因子与目标基因启动子中W-box 的结合能力，在调控靶蛋白转录中发挥作用[12-13]。

研究表明，WRKY 能够与启动子中W-box 转录元件特异结合，进而调控基因的转录。W-box 是WRKY 转录因子与DNA 结合所必需的最短序列，W-box 具有高度保守的C/TTGACT/C 氨基酸残基，其中，TGAC 为核心保守区[2]，任何一个核苷酸发生突变，都会影响与WRKY 转录因子结合的能力[14]，通过磷酸化反应也参与WRKY 与W-box 结合反应，磷酸化过程需要Zn2+参与[15-16]。

2 植物WRKY 转录因子分类

植物WRKY 转录因子家族普遍具有保守的WRKY 结构域和锌指结构域，根据结构域数量和结构域差异可分为3 类：第Ⅰ类具有2 个保守WRKY结构域和一个C2H2（CX4-5CX22-23HXH）型锌指结构，主要由C-端的WRKY 结构域参与DNA 结合反应，而N-段WRKY 结构域的功能和作用还未得到证实；第Ⅱ类只含一个WRKY 结构域，锌指结构也是C2H2 型，根据氨基酸序列差异可进一步将其分为IIa、IIb、IIc、IId 和IIe 5 个亚类[13]；第Ⅲ类WRKY 转录因子只含有一个WRKY 结构域，锌指结构为C2HC（CX7CX23HXC）型，这类转录因子仅在高等植物中发现[10，12-13]。

3 植物WRKY 转录因子的功能研究

3.1 参与生物逆境响应

植物抗病反应的信号转导途径是依靠抗病调控基因NPR1 以及抗病相关基因PR 建立起来的。WRKY 转录因子可以通过与NPR1 和PR 启动子中的W-box 元件结合，调节或启动基因的表达，进而激活植物防御反应[17-21]。DONG 等[22-23]通过基因芯片技术发现拟南芥NPRI 的表达受WRKY 基因调控。Northern 杂交实验表明，拟南芥74 个WRKY 转录因子中有49 个受SA 或病原菌诱导表达，参与植物抗病反应[24]。水稻WRKY45-1 和WRKY45-2 基因对稻瘟病抗性都起正调控作用[25]。CHENG 等[26]通过过表达和RNAi 技术研究表明，WRKY13、WRKY42、WRKY45-2 参与水稻对稻瘟病的抗性响应，其中，WRKY42 通过抑制JA 信号相关基因表达负调控对稻瘟病菌抗性。

JING 等[27]研究揭示了拟南芥WRKY70 能够连接水杨酸和茉莉酸信号转导通路，WRKY70 受到水杨酸激活而受茉莉酸抑制。过表达和基因敲除试验结果表明，WRKY70 基因能够激活SA 信号通路基因，同时，能够增强转基因株系对白粉病菌（Erysiphe cichoracerum）的抗性，而对黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的侵染则呈现敏感症状；揭示WRKY70基因在水杨酸和茉莉酸介导的抗病信号转导中都起到重要作用。

HAK-SEUNG 等[28]对水稻OsWRKY103 过表达植株中抗病相关基因的表达水平进行检测，结果显示，PR 等下游基因的表达都被上调。YODA 等[29]从烟草中克隆和鉴定出WRKY 转录因子家族TIZZ基因，并揭示了TIZZ 基因参与植物抗病不依赖水杨酸信号传导；水稻OsWRKY71 在水杨酸、茉莉酸、机械损伤以及病原菌侵染等多种信号转导途径中都起作用，过表达OsWRKY71 基因能够增强植株对水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）的抗性[30]。

有些WRKY 转录因子则对植物抗病反应起负调控因子作用。KANG-CHANG 等[31]研究发现，AtWRKY7 为转录抑制因子，AtWRKY7 突变体植株和RNAi 干涉植株都提高了对丁香假单胞细菌（Pseudomonas syringae）的抗性，同时，PR1 蛋白表达量上升，而过表达AtWRKY7 转基因株系则对丁香假单胞细菌敏感，同时PRl 蛋白表达下降、水杨酸含量上升。

WRKY 在植物对昆虫取食及其造成的机械损伤等胁迫的应答过程中也起着一定作用。MELANIE等[32]通过过表达和基因沉默试验揭示了WRKY3 和WRKY6 基因参与植物对昆虫取食伤害的应答，烟草WRKY3 的表达能够受昆虫取食造成的机械损伤诱导，WRKY6 则能受到烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫口内分泌的脂肪酸-氨基酸混合物（FACs）诱导表达。水稻WRKY 转录因子基因OsWRKY70 通过正向调控茉莉酸途径来调节植物对昆虫的抵抗，该基因可被赤霉素二化螟（Chilo suppressalis）取食强烈诱导，正向调控茉莉酸的合成并增强水稻植株对二化螟的抗性，另外，该基因还能反向调控赤霉素的合成，抑制水稻对褐飞虱（Nilaparvata lugens Stal）的抗性[33]。

3.2 参与非生物逆境响应

WRKY 转录因子家族还参与对非生物胁迫的应答反应。植物在伤害、盐害、干旱、热激、营养缺失、光照不足、植物激素和冷冻等非生物逆境环境下，体内一些WRKY 基因被诱导表达。通过基因芯片和Northern 实验分析拟南芥和水稻在低温、高温、干旱和盐害等非生物逆境胁迫中WRKY 基因的表达情况，结果表明，拟南芥中有40 个，水稻中有13 个表达明显上调，显示WRKY 转录因子在植物逆境胁迫反应中起到重要调控作用[34-35]。

蔡荣号[36]2013 年克隆获得玉米ZmWRKY58，并通过表达和RNAi 获得转基因水稻株系，对该株系的干旱处理及盐处理试验结果揭示，ZmWRKY58基因通过降低相对电导率、丙二醛含量提高了水稻的抗旱抗盐能力；李小明[37]2015 年研究发现，玉米ZmWRKY102 基因对干旱、高盐、ABA 等处理都有不同程度的诱导表达，转该基因拟南芥植株耐干旱性能显著提高，但对高盐胁迫敏感性增强，表明ZmWRKY102 参与植物的抗旱耐盐响应。蔡荣号[9]2016 年对玉米WRKYIId 亚家族基因进行克隆和功能研究，结果显示，ZmWRKY6 等7 个基因受干旱和高盐胁迫诱导，ZmWRKY114 则受高盐胁迫抑制表达；QIU 等[35]研究发现，水稻中OsWRKY8 等10 个基因受高盐、PEG、低温及高温胁迫诱导；QIU等[38]研究也揭示了OsWRKY45 能够提高拟南芥对盐害和干旱的抗性，并增强植株的抗病能力；转遏蓝菜基因TcWRKY53 降低了转基因烟草的渗透胁迫耐受性[39]；MARÈ 等[40]发现，大麦HvWRKY38 基因参与了植物的冷胁迫及干旱胁迫应答反应。

此外，还发现部分WRKY 基因受热激、冷害等温度相关胁迫诱导[41-44]。AtWRKY46 在胁迫应答及光依赖的气孔运动中发挥了重要的作用：一方面调控干旱和盐胁迫条件下植物细胞的渗透保护和降低氧化胁迫；另一方面通过调控保卫细胞中淀粉的代谢来调节气孔的打开[45]。拟南芥中过量表达玉米ZmWRKY33 基因也可以在一定程度上提高转基因植株抵抗盐胁迫的能力[46]。

WRKY 转录因子参与氧化胁迫和ROS 途径活性分子的代谢途径。在臭氧处理条件下，发现拟南芥中AtWRKY30、AtWRKY75 等6 个WRKY 家族基因的表达量均上调5 倍[47]。用甲基紫精（methyl viologen）诱导抗氧化烟草的过程中发现，NtWRKY11在处理后期表达显著上升，这表明NtWRKY11 是有可能参与植物氧化过程调节的候选基因[48]。YAN等[49]发现，棉花WRKY17 的表达不仅受非生物胁迫因子和机械损伤的诱导，还受ABA 和H2O2等诱导调节。过表达GhWRKY17 株系叶片中大量积累ROS，降低对干旱和盐害的抗性；活性氧代谢相关酶的活性和脯氨酸含量降低，表明GhWRKY17 通过影响ABA 信号通路提高体内ROS 水平，参与植物干旱和高盐胁迫反应。

WRKY 基因还参与机械损伤诱导表达，如烟草WIZZ 基因在受损伤时，10 min 后损伤诱导信号能在烟草叶片中快速传递，30 min 后达到最高峰，随后逐渐降至正常水平，表明WIZZ 基因响应烟草早期阶段的伤害[50]。拟南芥WRKY11、WRKY15、WRKY22、WRKY33、WRKY40、WRKY53、WRKY60和WRKY6 也受到伤害诱导[51-52]。

3.3 参与植物激素信号转导

WRKY 转录因子参与ABA、SA 以及JA 介导的信号转导[24]，AtWRKY70 蛋白是SA 与JA 介导抗病信号转导途径中调控交叉点[27，53-56]。拟南芥WRKY18，WRKY40 和WRKY60 通过调控ABA 信号转导途径中ABI4 和ABI5 基因转录来调控下游基因表达[57]。LtWRKY21 能够与HVA22 的启动子结合，并与VP1 和ABI5 相互作用激活该基因的转录，参与ABA 信号转导[58]。FAN 等[59]研究菊花CmWRKY1 基因的功能时发现，其能抑制PP2C、ABI1 和ABI2 基因的表达，能激活PYL2、SnRK2.2等基因的表达，参与植物的ABA 信号转导途径，过表达CmWRKY1 能够提高植株的抗旱性。

对水稻进行SA 和JA 处理，观察水稻中15 个被稻瘟病所诱导的WRKY 基因的表达情况，其中，4 个WRKY 基因被SA 所诱导，5 个WRKY 基因受JA 诱导[28]。拟南芥WRKY70 基因能够被水杨酸诱导表达，而茉莉酸则能明显抑制WRKY70 基因的表达，过量表达WRKY70 基因能够激活SA 诱导基因[27]。过表达AtWRKY39 能够增加SA 途径相关基因PR1 和MNF1c 的表达，同时，AtWRKY39 的表达能够被SA 和茉莉酸甲酯（MeJA）诱导，参与SA 和JA 信号转导途径调节植物耐高温反应[60]。AtWRKY38和AtWRKY62 能被NPR1 基因以及丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）诱导表达，过表达AtWRKY38和AtWRKY62 则能抑制防御基因AtPR1 的表达，揭示了AtWRKY38 和AtWRKY62 是NPR1 的下游基因，通过SA 途径参与植物的抗病性[61]。JIANG等[62]研究显示，AtWRKY57 在茉莉酸和生长素信号转导中也起到一定的作用。

3.4 参与植物的生长发育

WRKY 转录因子还参与种子休眠[63-64]、植物生长发育[65]以及衰老进程[52，66]。药用植物石斛（Retama raetam）的WRKY 基因除了参与植物抗旱途径外，还与种子休眠的过程相关[67]。拟南芥AtWRKY75 基因则能受缺磷胁迫强烈诱导，参与拟南芥缺磷响应[68]。

4 展望

近年来，随着人口增长和国民经济的飞速发展，农产品的供需矛盾日益突出。农作物的产量受到多种不利气候条件及病虫害的影响，因此，育种工作者的育种目标逐渐由单一抗性转向多抗性品种培育。转录因子作为植物体内重要的调控因子，在植物的整个生长发育过程中都起着重要作用。目前，WRKY 转录因子在参与植物抗逆响应中的功能研究越来越受重视，WRKY 家族不仅成员众多，参与的调控网络也十分复杂，目前人们对某些该家族基因的上游调控基因以及下游影响基因已经有了一定的了解，但许多调控节点及调控方式仍旧是空白。随着研究的进一步深入，人们将会掌握不同植物中该基因家族的更多信息，更好地为使用基因工程手段改良作物抗逆性提供基因资源和改良思路。