文山州兽医实验室PCR检测问题及对策

李碧凤 赵敏 张绍卫 袁正春

（云南省文山州动物疫病预防控制中心 663000）

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是近几十年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一[1]，其已发展为成熟的病原学检测技术之一。自1985 年PCR 技术问世以来，随着现代医学和分子生物学的飞速发展，PCR 技术不仅对世界生物医学的研究有巨大推动作用，而且在兽医学的基础研究、临床应用及基层兽医生产实践检测工作方面也发挥着越来越重要的作用。文山州动物疫病预防控制中心于2017 年建成兽医分子生物学实验室，中心兽医人员缺乏分子生物学技术相关知识，且基层兽医人员工作内容复杂，学习交流圈子窄、信息闭塞，对分子生物学PCR 检测技术原理及其在基层兽医实验室中的应用认识有限。因此，全面分析总结2017～2019 年文山州兽医实验室检测技术人员在应用PCR 检测方法中检（监）测样品、仪器设备的使用、检测技术人员及实验室生物安全等方面存在的问题，并提出实际有效的对策与措施，以期为基层兽医更好地运用PCR 检测技术开展基层动物疫病防控工作提供一些参考。

1 文山州兽医实验室及PCR 应用概况

根据《中华人民共和国动物防疫法》，动物疫病预防控制机构按照国务院兽医主管部门的规定，对动物疫病的发生、流行等情况进行监测。地市一级的动物疫病预防控制机构是执行重大动物疫病监测的一线主体，其兽医实验室承担着动物疫病诊断、检测、动物免疫状况调查、监测等工作，是动物疫病预防控制机构的技术保障与根基。随着国家对兽医系统实验室建设投资力度的加大，文山州动物疫病预防控制中心于2017 年在云南省动物疫病预防控制中心的协助和技术指导下，文山州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室建成并投入使用。文山州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室是文山壮族苗族自治州唯一一个具有PCR 病原学检测、监测技术能力的实验室。兽医分子生物学实验室运用PCR 技术建立了符合当地高致病性禽流感病原检测、监测的PCR 检测方法，并建立了文山州高致病性禽流感监测预警体系[2]，在2017～2019 年成功控制和处置了文山州区域内的H7N9亚型禽流感及其他重大动物疫情。

文山州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室的建设，为文山州动物疫病的检测、监测技术从血清学抗体检测逐步向病原学PCR 检测技术方向发展提供了基础平台。于2018年中心实验室因实际病原学检测与监测工作的需求，新购入一台PCR 仪。2019 年因非洲猪瘟疫情的爆发，检测样品数量的剧增购入一台全自动核酸提取仪；先进仪器设备的补充，促进了文山州兽医分子生物学实验室高致病性禽流感、非洲猪瘟、新城疫、猪瘟、高致病性猪蓝耳、口蹄疫、小反刍兽疫等病原学PCR 检测、监测工作的快速开展。2017～2019 年兽医分子生物学实验室运用PCR 技术开展文山州活禽交易市场、规模养禽场以及预警监测点的禽流感监测，全面掌握全州禽流感疫情动态，做到底子清、情况明，为全州禽流感的疫情防控提供有效手段，有效阻断大规模禽流感疫情的爆发。同时对猪瘟、高致病性猪蓝耳、口蹄疫、小反刍兽疫等疫病开展紧急PCR 检测与集中PCR 病原学监测，为文山州动物疫控中心开展重大动物疫病防控决策提供科学的实验数据。因非洲猪瘟爆发，2019 年病原学检测、监测工作在新增仪器的有效运转下，完成大批量ASF 样品PCR 检测，为基层兽医及时检测诊断非洲猪瘟可疑样品、快速采取非洲猪瘟防控措施提供了科学技术支持。

2 应用PCR 检测方法存在的问题

2.1 PCR 检（监）测样品

在PCR 样品品质问题。高致病性禽流感、新城疫病原学的检测与监测，其样品主要采集禽类的咽喉、泄殖腔、环境、运输工具棉拭子，基层兽医人员对采集棉拭子所需的保存液的配制及加入多少在实际操作中存在许多问题。很多基层兽医人员为了方便工作省去保存液的灭菌步骤；有的样品里无保存液；有的则加入保存液的量只够棉拭子吸取无法用于核酸提取；而采集喉气管组织样品时又出现只见喉头不见气管或只见气管不见喉头；以及样品腐败变质、盛放随意等问题。猪瘟、高致病性猪蓝耳病检测、监测的样品大多采集全血或脾肺或扁桃体，这在基层常出现采集的是血清不是全血；采集全血的试管因保存不当而破裂；采集的组织太大或太小不符合要求。非洲猪瘟检测与监测的样品也出现同样的问题与现象。许多检测、监测样品的包装、保存与运输上不符合国家《高致病性病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》规定。样品的标记与采样表填写不清楚、信息不全等。这些不规范、低品质样品无法准确有效地用于PCR 实验，不能真实反映出病原情况，无法溯源和为实际的疫情防控工作提供科学的预警依据。

2.2 PCR 检测仪器设备的使用

PCR 病原学检测技术中重要的几种仪器设备主要是冷冻离心机、低温冰箱、生物安全柜、全自动核酸提取仪、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像系统等。这些仪器的操作与维护关系到PCR检测结果的准确性、有效性。如普通的低温冰箱，通常-20℃储存PCR 试剂（酶、引物、dNTP 混合物等），若没有正常的维护与温度检查记录，冰箱因不明原因不能维持-20℃工作，实验室人员不能及时发现，导致保存在这个冰箱中的PCR 试剂（尤其是酶与引物）不稳定，检测时影响到实验结果（实际工作中出现一次情况，导致检测的实验结果不可用）。生物安全柜的正确使用关系到整个PCR 实验室污染源的防控，其消毒、清洁环节是对PCR 实验的核酸提取、体系配置等操作外环境的控制。全自动核酸提取仪是获取样本核酸的关键步骤，熟悉仪器的性能、规范操作使用该仪器是PCR 实验成功的关键步骤。使用全自动核酸提取仪时不可忽略核酸提取试剂盒的查验，该试剂盒为试剂公司批量生产，其加入的试剂不免也会出现漏加现象，在实际工作中就遇到有些试剂盒中漏加磁珠的问题，此外手动加入样品时其编号不可打乱，以免样品与最终的实验结果不能一一对应，更不能少加或漏加提取核酸用的酶。PCR 实验中PCR 仪的使用与维护对PCR 检测的结果具有直接影响，PCR程序的设置因不同病原体检测其程序各不相同，切勿在使用过程中因慌忙而点错程序，程序运行前一定检查核对正确后再点击开始。电泳仪的使用要注意电泳液的配置与电源线正负极的插入，长时间重复使用电泳槽中的电泳液会影响样品电泳的效果，应适时更换新配置的电泳液，放置电泳的胶块时切忌方向不能放反，否则PCR 产物跑出胶块后无法获得实验结果。凝胶成像系统是得出PCR 试验结果使用的最后仪器，对于该仪器的使用需要做好培训与指导，实际操作中步骤虽然简单，但不可粗心大意。

2.3 PCR 检测技术人员

一是检测技术人员缺乏的问题。在基层兽医实验室人员配备数量与实际需求不符[3]，这是基层兽医实验室中的普遍现象；文山州中心兽医实验室仅有3 名PCR 实验室检测技术人员，这与实际实验室检测、监测工作需求不符；基层兽医从事实验室工作多为兼职人员，中心3 名实验室检测技术人员除承担高致病性禽流感、新城疫、非洲猪瘟、猪瘟、高致病性猪蓝耳、口蹄疫、小反刍兽疫等病原学检测与监测工作外，还负责抗体监测、春秋防疫工作、兽药饲料检测及其他行政工作等。二是人员的基础知识、检测技术问题。实验室检测技术人员缺乏分子生物学理论基础知识，疏于对PCR 技术知识的学习与更新，对检测原理知其然而不知其所以然，无法正确判断或发现实际检测工作中的许多细节问题。如为何一人所做的PCR 实验其阴、阳性对照组出现不同的结果（假阳性、假阴性）；为何同一样品重复多次检测，其结果各不相同；为何有些样品PCR条带出现拖尾，有些样品条带明亮整齐但却不是目的条带；PCR 电泳中为何有些产物只是肉眼可见一条染色带，有些产物则肉眼可见两条染色带等问题。基层兽医实验人员大多知道做PCR 实验的整个流程，而缺乏分析和解决实验中实际问题的能力，中心兽医实验人员无有效途径进行PCR 检测技术知识的交流学习与更新。目前中心兽医实验室人员在从事病原学检测工作前多从事屠宰检疫或其他方面的工作，且年龄普遍偏大（年龄在50 岁左右），对精细的分子生物学PCR 检测工作存在一些操作上粗心大意的问题，不熟悉移液枪的使用导致取液不准确；动作该轻柔的地方反而剧烈震荡；配制不同PCR 检测体系容易混淆等。

2.4 PCR 实验室生物安全问题

兽医实验室的生物安全是开展动物疫病病原正常检测与监测工作的重要保障，是实验室人员身体健康与安全的基本保障。兽医实验室工作人员在进行PCR 病原学监测与检测工作时接触的病原样本复杂多样，其中不乏一些人畜共患病（高致病性禽流感、布鲁氏菌病、狂犬病等）样品。如2019 年12 月，某研究所人员因做实验感染了布鲁氏菌病（简称布病），用血的教训证明生物安全实验室是一把“双刃剑”，它既是动物疫病防控的实验技术平台也是最易造成病原传播和感染人员的危险场所[4]，基层兽医实验室人员长期工作在生产一线，存在极大的生物安全隐患[5]，因此，PCR 实验室的生物安全管理与防护十分重要。中心兽医分子生物学实验室在办公楼三楼，除兽医实验室外还有3 间相邻的办公室，兽医实验室的分子生物安全问题不仅限于实验室区域也关系到外围办公区和单位周边的广大居民的安全问题。

3 采取的对策与措施

3.1 规范样品的采集、包装、运输

针对采集样品不规范的问题，文山州动物疫病预防控制中心邀请专业技术人员对基层兽医进行多次动物疫病检测、监测采样技术培训。通过与基层兽医面对面沟通交流，从样品采集、采集工具的运用、采集信息的填写、不同动物疫病样品的采集方法等方面答疑解惑，从而使基层兽医人员对采集合格的动物疫病病原学检测、监测样品有了充分的认识，并在实际采样工作中执行到位，有效提高文山州动物疫病病原学PCR 检测、监测样品的品质。这在多次培训后收到的检测、监测样品情况中得以体现，样品品质基本符合对应检测、监测病原的条件与要求，大大方便了检测工作的开展及动物疫病病原的追溯。针对样品包装与运输，中心实验室采取集中培训指导，强制性按不同动物疫病病原样本运输包装规范执行送样，若不符合规定的则拒绝接收和检测样品，出现问题的则采取严厉处罚措施，并通报批评。

3.2 规范PCR 检测仪器设备的使用与维护

检测仪器设备的使用与维护是确保PCR 实验正常进行的基础设施保障，是技术保障中的基石。针对仪器设备的有效使用与维护，中心兽医实验室制定了分子生物学仪器设备档案管理、仪器设备使用与维护程序文件，仪器设备管理员实名制管理与维护。并采取专人培训指导实验室检测人员对不同仪器设备的正确、有效使用，最大化地提高仪器设备的有效利用率。建立仪器设备使用记录实时登记制度，不仅有利于检测技术人员时刻规范自我检测操作过程，且便于实验室质量监督人员的技术监督管理。同时为PCR 检测实验过程留下痕迹可查可验，有助于实验室检测技术人员查找实验过程中出现的细节问题。

3.3 加强PCR 检测技术人员的管理与培训指导

基层兽医实验技术人员需要通过不断学习与交流丰富分子生物学基础知识，训练及规范PCR 实验操作技术，提高实验操作技术与分析解决实验问题的能力。中心为兽医实验技术人员提高综合技术能力采取“送出去，请进来”的培养方式，即送技术人员出去学习的同时也请专家到本地培训指导。与此同时，增加实验室检测技术人员在分子生物学知识及技术方面的交流学习机会，扩宽实验技术人员对PCR 技术及新发展的其他实验技术的学习途径。且通过加强引导检测技术人员的学习，优化试剂、仪器、样本、环境等的管理，强化检测方法、检测过程的管控，积极参与国家、省级组织的检测能力比对实验等外部质量控制[6，7]，有效地提高中心兽医实验室的PCR 检测技术能力。

3.4 加强兽医实验室生物安全管理

中心兽医实验室通过制定相应的实验室生物安全操作技术规范、废弃物处理操作程序、实验室生物安全程序文件及实验室生物安全标准操作规程等，全面涵盖国家《实验室生物安全通用要求》中的各项生物安全管理[8]。且对兽医实验室开展管理评审和内部审核工作，对兽医实验室涉及的病原微生物及从事的实验活动各方面进行风险评估，以风险评估为基础，从根本上确保实验室生物安全[9]。加大实验室生物安全防护机制的建设与措施的落实，提高基层兽医实验室检测人员生物安全防护意识，确保实验室各项生物安全技术达标，保证兽医分子生物学实验室工作安全的有序开展。