磁光复合纳米药物载体的制备及表征综合型教学实验设计与实践

李晓舟，王 林, 帅 琪，龚 宁

（西北农林科技大学 化学与药学院，陕西 杨凌 712100）

应用型人才培养是高等教育的主要任务[1]， 而实践能力和创新精神是评价人才的重要指标[2]。实践教学是本科教学中体现实践能力获取、创新精神培养、综合素质提升的关键环节[3]，在整个教学体系中具有极其重要的地位，其教学效果直接影响高等教育的人才培养质量。设计并开设研究型综合实验，用以激发学生的求知欲望和创新思维，提高学生分析和解决问题的能力，是促进实践人才培养以及推动学科发展的有效举措[4]，既能满足实践教学的要求，又符合培养应用型人才的教学目的。

纳米药物载体的设计是当今科研领域的研究热点[5-6]，本文结合本学院的专业特色，设计了磁光复合型纳米药物载体的制备及表征综合型实验。通过具体的实践操作及对实验现象的讨论分析，使学生学习纳米材料的合成技术和表征手段，培养学生的科学研究思维以及运用理论知识解决实际问题的能力。

1 实验设计

1.1 实验原理

当前，纳米药物传输系统在癌症治疗领域备受关注[7-8]。磁性纳米颗粒，如Fe3O4纳米粒与药物复合可阻断肿瘤血管生成、促使肿瘤组织缺血坏死、防止癌细胞扩散，还可以通过磁共振成像跟踪药物输送过程及其在生物体内的分布。此外，在交变磁场的作用下，超顺磁性的纳米粒子吸收能量产生热能，可以具有热疗功能[9-10]。

为防止Fe3O4化学氧化而对组织产生不良影响，可以用化学惰性和生物相容性的 SiO2微球[11]包覆Fe3O4，制备核壳结构的Fe3O4@SiO2复合纳米粒。再以异硫氰荧光素标记的聚乙烯亚胺聚合物（FITC-PEI）和生物大分子硫酸软骨素（CS）为制膜单元，利用层状组装技术在Fe3O4@SiO2微球表面沉积FITC-PEI/CS多层膜， 可制备磁光复合型 Fe3O4@SiO2@(FITCPAHD/CS)4载体微球。荧光分子异硫氰荧光素的修饰，可赋予载体微球荧光性能，便于利用荧光显微镜监测载体微球在体内的移动。另外，利用微球表面聚合物多层膜的溶胀性质，可实现对药物小分子的装载及控制释放。实验总体方案如图1 所示。

图1 实验方案示意图

1.2 实验目的

本实验的目的为：

（1）学习Fe3O4和核壳结构Fe3O4@SiO2纳米粒子的制备方法；

（2）学习用层状组装技术制备超分子薄膜材料；

（3）掌握磁性纳米材料的基本表征方法；

（4）学习用数学模型拟合药物释放行为，并从动力学角度分析释药机理。

1.3 实验试剂与仪器

实验试剂包括：FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水、盐酸、氢氧化钠、正硅酸乙酯（TEOS）、无水乙醇、柠檬酸钠、硫酸软骨素（chondroitin sulphate，简称CS，重均分子量Mw100 000～200 000）、聚乙烯亚胺（poly ethylene imine，简称PEI，重均分子量Mw 为25 000）、异硫氰根荧光素（FITC）等，均为分析纯，以及布洛芬（纯度98.0%）、透析带（截流分子量为8 000～12 000）、高纯氮气和去离子水。

实验仪器包括：日本岛津公司AUY220 型电子天平，上海精科公司雷磁PHS-3C 型pH 计，日本岛津公司UV-1800 型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司RF-5301PC 型荧光分光光度计，MPMS-XL 超导量子干涉磁力仪，TGL-16 型高速离心机，三颈瓶，移液器，恒压漏斗，离心管，石英片（规格：1 cm×2 cm）。

1.4 实验步骤与方法

1.4.1 Fe3O4@SiO2纳米粒子的制备

利用共水解法制备 Fe3O4纳米粒子[12-13]。 向100.0 mL 的三颈瓶中加入50.0 mL 去离子水（使用前通入高纯氮气20 min 以上，去除水中溶解的氧）和3.5 mL 氨水。称取0.010 0 g FeCl2·4H2O 置于离心管中，移取5.0 mL、0.02 mol·L-1的FeCl3·6H2O (用0.1 mol·L-1的盐酸配制) 溶液加入离心管，轻轻摇晃至FeCl2·4H2O 完全溶解，迅速将混合液倒入三颈瓶中制得Fe3O4纳米粒子（以Fe3O4分子为基本单元，物质的量为0.05 mmol），反应过程中，始终向溶液通入高纯氮气，防止Fe2+氧化。将Fe3O4@SiO2水溶胶在磁场下分离，将所得到的固体微粒用乙醇洗3 次，再溶于8 mL 乙醇中备用。

将上步制得的Fe3O4纳米粒子水洗并磁分离两次后，用25.0 mL 除氧去离子水溶解，用1 mol·L-1盐酸调节其pH 值小于6，得到A 溶液。称取2.250 0 g 柠檬酸钠（SC），用25.0 mL 除氧去离子水溶解，得到B 溶液。然后将A 溶液和B 溶液混合，加热至90 ℃左右，氮气饱和下反应30 min，可得SC-Fe3O4溶液（以Fe3O4分子为基本单元，浓度为1.0 μmol·mL-1）。

向150.0 mL 三颈瓶中顺序加入26.0 mL 除氧去离子水、20.0 mL 无水乙醇、2.8 mL 氨水、10.0 mL SC-Fe3O4溶液，搅拌使溶液混合均匀。量取0.5 mL正硅酸乙酯、44.5 mL 无水乙醇加入恒压漏斗中混合均匀，将混合液逐滴加入三颈瓶中，全部滴完后，将三颈瓶中的混合液在常温下继续反应6 h。

1.4.2 FITC 标记PEI

移取 20 µL FITC 的二甲基亚矾 DMSO 溶液（ 0.1 mmol·L-1） 加 入 到 10.0 mL PEI 水 溶 液（5.0 mg·mL-1）中，避光搅拌24 h 使之完全反应，透析3 次，每次30 min，以除去DMSO 和未反应的FITC，将获得的FITC-PEI 溶液稀释至50.0 mL（PEI 的浓度为1 mg·mL-1），避光保存。

1.4.3 Fe3O4@SiO2@FITC-PEI/CS 载体微球的制备

分别取制得的 Fe3O4@SiO2的乙醇溶液0.5 mL 于三个离心管中，水洗并离心分离两次，分别加入3.0 mL FITC-PEI（1 mg·L-1，pH=10.0）溶液，20 min 后离心分离，水洗并离心分离两次，再分别加入3.0 mL CS（1 mg·L-1，pH=10.0）溶液，20 min 后离心分离，水洗并离心分离两次。再重复上述薄膜沉积程序3 次，即可得Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4载体微球。

1.4.4 Fe3O4@SiO2@FITC-PEI/CS 负载与释放布洛芬

将Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4载体微球水洗并离心后，浸泡在3.0 mL 的布洛芬（约10 mmol·L-1，用1 mmol·L-1的盐酸和NaOH 调节其pH 为7.0）水溶液中，吸附2 h 后离心分离，可获得载药微球。

将装载了布洛芬的微球浸泡在3.0 mL 0.9%的生理盐水（pH=7.4）中，使微球装载的药物分子通过离子交换和扩散作用从载体中释放出来，每隔一段时间更换生理盐水，以保证释放条件相同。监测生理盐水在 220 nm 处的吸光度值，利用布洛芬在0.9%生理盐水中的标准曲线来计算从载体中释放的布洛芬的量。1.4.5 布洛芬标准曲线绘制

分别取50.0 mg·L-1的布洛芬标准溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 于25.00 mL 的容量瓶中，用生理盐水定容，摇匀。以生理盐水为参比，用石英比色皿在220 nm 处测量各标准溶液的吸光度值，绘制吸光度与布洛芬浓度的关系曲线，得到标准曲线。

1.5 测试与表征

（1）利用超导量子干涉磁力仪测试Fe3O4纳米粒子及Fe3O4@SiO2微粒的磁性。利用磁铁测试Fe3O4、Fe3O4@SiO2及Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4载体微球在水溶液中的磁响应性。

（ 2 ） 利用扫描电子显微镜， 观察 Fe3O4和Fe3O4@SiO2微粒的形状及尺寸。

（3）以石英片为基底，利用紫外-可见分光光度计，监测FITC-PEI/CS 薄膜的沉积过程。

（4）在200～800 nm 范围内，扫描Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4载体微球的吸收光谱和荧光发射光谱。

（5）利用荧光显微镜观察Fe3O4@SiO2@(FITCPEI/CS)4载体微球的荧光现象。

（6）利用透射电子显微镜，观察Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4载体微球的形貌及尺寸。

1.6 结果与讨论

（1）根据表征结果，比较 Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@SiO2微粒的磁性大小，讨论SiO2壳层对Fe3O4纳米粒子磁性的影响；对比研究Fe3O4纳米粒子、Fe3O4@SiO2微粒及Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4载体微球在水溶液中对磁场的响应性及再分散性。

（2）根据荧光光谱和荧光显微镜的表征结果，讨论Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4微球的荧光性能，推测其能否实现体内的荧光追踪。

（3）观察分析电镜测试照片，统计Fe3O4纳米粒子、Fe3O4@SiO2微粒及Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4载体微球的尺寸分布，解释说明三种微粒的形状及形貌。

（4）根据药物释放实验结果，绘制布洛芬释放动力学曲线，讨论其释放行为，尝试用模型拟合。

2 实践结果

将所设计的实验以大学生科创实验的形式进行了初步实施，旨在检验其可行性。实施结果表明，学生能够按照设计方案顺利完成全部实验，并取得了如下实践成果：

（1）学生分别利用Fe(II)氧化法、Fe(III)还原法和共水解法制备了Fe3O4粒子。证明了共水解法可制备在水中高度分散、纳米尺度的Fe3O4粒子，电镜结果表明，此法制得的Fe3O4粒子的平均尺寸在6 nm 左右。

（2）用柠檬酸修饰Fe3O4粒子，再用SiO2包裹，制备出了核壳结构、生物相容性的Fe3O4@ SiO2微粒。电镜测试表明，该微粒为球形，尺寸均一，约为360 nm。

（3）将荧光分子FITC 标记到PEI 聚合物上，并利用层层组装技术，在Fe3O4@ SiO2微球表面沉积了4 个周期的FITC-PEI/CS 薄膜，制备出了磁光复合型载体微球Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4。从透射电镜照片可以清晰看到微球表面的聚合物膜层，聚合物薄膜的修饰使载体微球的尺寸比Fe3O4@SiO2微球有小幅增加。

（4）分光光度分析证明，所制备的载体微球可以装载布洛芬药物小分子，并且所装载的布洛芬小分子可在生理盐水中长效释放。通过绘制释放动力学曲线和拟合模型，可推测药物从载体中释放的主要原因是，微球表面聚合物膜的溶胀及离子交换作用，而扩散决定了药物的释放行为。

（5）利用超导量子干涉磁力仪、荧光分光光度计、荧光显微镜等仪器对Fe3O4、Fe3O4@ SiO2和Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4微球进行了表征。结果表明，这些纳米微粒均具有超顺磁性及优异的磁响应性，Fe3O4@SiO2@(FITC-PEI/CS)4载体微球拥有FITC 的特征吸收峰和荧光发射峰, 可利用荧光显微镜方便地进行监测。

3 结语

“磁光复合纳米药物载体的制备及表征” 这一科研型实验，包含了无机合成方法、有机反应、超分子层层组装技术、动力学研究以及各种分析表征方法的使用，体现了多学科交叉融合的特征，适用于培养学生的综合实践能力及创新思维。实践结果验证了实验方案设计的合理性、可行性，学生对实验内容表现出极高的兴趣，因此可将该科研型实验引入本科综合实验教学中。