西班牙河碳酸盐岩对茶园土壤状况和土壤细菌群落的影响

赵 茜，施龙清，黄世勇，丁鲁平，Liette Vasseur，杨 广*

（1. 闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室/福建农林大学应用生态研究所，福建 福州 350002；2. 福建农林大学教育部害虫生态防控国际合作联合实验室，福建 福州 350002；3. 农业农村部闽台作物有害生物综合治理重点实验室，福建 福州350002；4. 害虫绿色防控福建省高等学校重点实验室，福建 福州 350002；5. 福建省农业科学院水稻研究所，福建 福州 350019；6. 武夷山市种子站，福建 武夷山 354300；7. 博莱生态农业科技有限公司，北京 100000；8. 加拿大布鲁克大学生物科学系，安大略 圣凯瑟琳斯 L2S3A1）

0 引言

【研究意义】福建省是中国乌龙茶之乡，是名茶铁观音、武夷岩茶的发源地，位居中国重点产茶省份之首。土壤作为茶树生长赖以生存的营养来源，其酸化程度对茶树的生长及茶叶的品质有重要影响。然而，目前福建省土壤pH 值适宜茶树生长的茶园比例还不足15%，pH 值在4.5 以下的茶园占比87%[1]，茶园土壤酸化成为影响茶树生长、茶叶品质的关键因素。土壤酸化不仅造成钙离子、锰离子、钾离子等大量流失，大大降低土壤磷、钼和硼的有效性，致使土壤肥力显著下降[1−2]，而且可导致重金属元素的活化[3]，重金属在土壤中的不断积累，最终可通过茶叶危害人类健康，成为茶叶质量安全的主要限制因素[4−6]。除此之外，土壤酸化还会减少土壤中有益微生物的活性和数量，进而影响土壤中碳、氮、硫、磷等的循环[3]，导致茶树根的发育受阻，阻止养分的吸收[7]，最终影响茶树生长和茶叶品质。因此，有效缓解茶园土壤酸化进程，对提高茶叶品质和发展茶叶质量安全生产等具有重要的意义。【前人研究进展】茶树属于喜酸植物，但是由于长期施肥不合理以及茶树特性[2]，导致我国茶园土壤酸化程度日益严重。土壤酸化可带来一系列问题，首先是土壤重金属的活化[8]；茶园土壤酸度降低会导致土壤吸附重金属离子的能力降低，从而活化重金属，使重金属溶解性、移动性和有效性增加[9]。目前，我国农田重金属污染主要分为5 种健康风险元素，包括Cd、As、Hg、Pb 和Cr；以及3 种生态风险元素，包括Ni、Cu 和Zn[10]。鉴于茶园重金属污染主要暴露途径是通过茶叶对人体健康造成损害，因此茶园重金属污染主要检测上述5 种健康风险元素，其中更以Cd 为主[10]。钟晓兰等[11]的研究发现，土壤酸性增加能增强土壤活性态Cd 的含量，且随着pH 的降低，Cd 活化能力增高，土壤Cd 含量越高。其次，茶园土壤酸化可导致土壤有益微生物的活性降低和菌落组成减少[8,12]。茶园微生物具有固氮、解磷、释钾、分解有机物和保持土壤保湿性等作用，可以有效调节茶园生态，促进茶的芽萌发，影响茶树次生代谢。除此之外，还可以帮助合成茶叶特殊的芳香物质，对茶树生长、茶叶品质提高具有积极的影响[12−13]。然而，随着近年来茶园集约化的高强度生产，福建省茶园土壤酸化呈加重趋势。因此，为了有效遏制土壤酸化、确保农产品的食品安全生产，需要找到快速、有效遏制的防治策略。西班牙河碳酸盐岩（Spanish river carbonatite, SRC）作为酸性土壤调理剂、草碳堆肥和矿物肥料，具有碱性强，微量元素高、有害元素低等优势，已在加拿大、俄罗斯等国家应用[14−15]。在我国，SRC 已证明可以显著改良蔬菜种植土壤的酸性，例如，陈云峰等[15]采用大田和室内试验证明SRC 对种植小白菜的土壤酸性具有明显的改良效果。【本研究切入点】然而，SRC 对于茶园土壤酸化的改良效果还未可知，其在茶园的相关应用调查还未见报道。【拟解决的关键问题】为验证SRC 在茶园土壤改良方面的应用潜力，采用盆栽和大田试验分别验证SRC 对土壤酸性、土壤重金属及土壤微生物的影响，测定土壤pH 值、重金属含量、并利用高通量测序技术检测微生物群落结构，评估SRC 对茶园土壤理化性质改良和修复的情况，以有效减缓茶园土壤酸化进程，保障茶园可持续发展。

1 材料与方法

1.1 室内试验设计

室内试验所用土壤为红壤，取自福建农林大学南区茶园温室土壤，pH 6.13。本研究在不施化肥条件下进行。新鲜土壤粉碎，去除枯枝落叶等杂质后，过3 cm 筛子备用。取7 份土壤，其中3 份土壤（每份土壤重量不少于200 g）进行微生物多样性检测，并测定pH 值及8 种重金属（Cd、Pb、Cr、Cu 和Zn、Ni、Hg、As）的含量[CK（2017）]。本研究所用的碳酸盐岩由博莱生态农业科技有限公司提供，主要成分 SiO224.6%、CaO 28.3%、N 0.30%、P2O53.13%、K2O 1.07%、pH 8.92，容重 1.52 g·cm−3，为颗粒状固体。剩余4 份土壤分别按体积比土壤∶SRC=80∶20、90∶10、95∶5 和99∶1 进行混合（即分别对应为处理组20%SRC、10%SRC、5%SRC 和1%SRC），同时留一组土壤不掺入SRC，作为对照。每个处理组或对照土壤分别装入3 个花盆（45 cm×20 cm×15 cm，长×宽×高），每个花盆种植2 年生毛蟹品种茶树苗10 株。茶苗在室外恢复半月后移至室内条件，LED 灯光照，光周期12 h∶12 h，温度（28±1）℃，相对湿度（70±5）%，生长至2018 年6 月12 日[CK（2018）]，每个花盆内取土约50 g 进行微生物多样性检测分析以及pH 值测定，并检测Cd、Pb、Cr、Cu 和Zn、Ni、Hg、As 等8 种重金属的含量。

1.2 大田试验设计

试验地位于福建省泉州市安溪县西坪镇红星茶场内茶园（简称红星茶园，25°0′15.76″N，117°52′0.04″E;海拔700～750 m）。茶园面积约40 000 m2，该茶园试验地为有机试验茶园，不施用化肥、农药等。该地区属于亚热带湿润季风气候，气温在16～19 ℃，年降水量在1 700～2 100 mm。茶园种植茶树品种为毛蟹，种植年限在50 年以上，茶园土壤为红壤。2018 年7 月14 日，在茶园内选择6 块茶树地块，每块地面积约300 m2。在6 块试验地利用5 点取样法采取土样，采样部位选自茶树与施肥沟的中央位置，去除表面枯枝落叶层后0～20 cm 的土层。利用工兵铲和锄头挖掘采样断面，用竹铲去除与工具接触的部分后，在整个断面层均衡取样，土壤样本混合均匀后分为3 份，用于土壤微生物多样性检测、pH 值测定，以及Cd、Pb、Cr、Cu、Zn、Ni、Hg 和As 等8 种重金属的含量检测。随后，在6 块试验地中随机选择3 块，按1 120 kg·hm−2在茶树主干土壤附近撒施SRC。2019 年10 月14 日，在6 块试验地按上述方法取土壤进行微生物、pH 值及重金属检测。

1.3 土壤pH、重金属含量分析

取土样10 g 放入50 mL 烧杯中，加入25 mL 水，用玻璃棒剧烈搅动2 min，静置30 min，用台式pH计[型号：FF28，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，METTLER TOLEDO]进行检测。

土样中Hg 和As 的含量使用原子荧光法进行测定，详细方法参照国家标准《土壤质量 总汞、总砷、总铅的测定 原子荧光法GB/T 22105.1—2008》；其他6 种重金属采用原子吸收分光光度法进行检测，参考标准为《土壤质量 铅、镉的测定 石墨炉原子吸收分光光度法GB/T 17141—1997》、《土壤总铬的测定火焰原子吸收分光光度法HJ 491—2009》、《土壤质量锌、铜的测定 火焰原子吸收分光光度法GB/T 17138—1997》、《土壤质量镍的测定 火焰原子吸收分光光度法GB/T 17139—1997》。

1.4 土壤细菌DNA 的提取和纯化

用 DNeasy Power Soil Kit （QIAGEN, Inc.,Netherlands）试剂盒进行微生物总DNA 的提取，并将提取的DNA 保存于−20 ℃冰箱内。分别用NanoDrop ND-1000 核酸检测仪（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）和0.8%琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行品质检测；同时采用紫外分光光度计对提取的DNA 进行定量。

以细菌核糖体RNA 等能够反映菌群组成和多样性的目标序列为靶点，以稀释后的DNA 作为模板，应用带Barcode 的特异引物515F（5′-GTGCCAGCM GCCGCGGTAA-3′）和907R （5′-CCGTCAATTCMT TTRAGTTT-3′）对细菌16S V4 区进行PCR 扩增，PCR采用25 μL 反应体系：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，上 下 游 引 物 各1 μL，DNA 模 板1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL，dNTP Mix 0.5 μL, ddH2O 8.5 μL，使用PCR 仪 器是Bio-rad T100 梯度PCR 仪。程序设定为：98 ℃预变性2 min；25 个循环（98 ℃变性15 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s）；然后72 ℃延伸5 min。PCR 产物使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR 扩增产物用磁珠纯化回收。将纯化回收的PCR 产物进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader（BioTek，FLx800）。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。

1.5 土壤细菌DNA 多样性分析

依照Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制备测序文库流程进行文库制备；通过2%琼脂糖凝胶电泳，对文库做最终的片段选择与纯化。上机测序前，需要先对文库在Agilent Bioanalyzer上进行质检，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit。合格的文库有且只有单一的峰，且无接头，之后，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在Promega QuantiFluor 荧光定量系统上对文库进行定量，合格的文库浓度应在2 nmol·L−1以上；将合格的各上机测序文库（Index 序列不可重复）梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH 变性为单链进行上机测序；使用MiSeq 测序仪进行双端测序。

通过质量初筛的原始序列按照index 和barcode信息，进行文库和样本划分，并去除barcode 序列。利用FLASH（v 1.2.7）对每个样本的reads 进行拼接。本研究主要利用QIIME 和R（v3.2.0）包对数据进行分析。利用QIIME 对细菌进行OUT 聚类，并计算细菌的多样性指数，包括丰富度指数（CHAO1、ACE）、辛普森多样性指数（Simpson index）、香农多样性指数（Shannon diversity index）。利用R 包进行细菌群落间差异性 分析（ttest 以及Monte Carlo permutation test）。同时，为了降低噪音，利用R 包（v3.2.0），选取了丰度前5%的菌落进行属水平的主成分分析（PCA）。并对所选取的丰度前5%的菌落，利用聚类分析（Hierarchical clustering）的方法，基于非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）评价不同土壤样本之间的相似度。

2 结果与分析

2.1 SRC 对室内盆栽茶树土壤pH 及重金属的改良

与2017 年处理前土样相比，2018 年对照组土样pH 值有降低，但是降低的并不显著（表1），说明较短时间（如一年内）种植茶树不能显著改变土壤pH。然而，种植茶树可显著影响土壤重金属的含量。如室内盆栽种植茶苗一年后，土壤中的重金属Cr、Pb、Ni、As、Zn 的含量发生显著富集（表1）。为了探索SRC 对土壤酸碱度、重金属的调节作用，分析了4 种SRC 浓度对土壤的改良效果，结果显示：与2018 年对照组相比（5.93 ± 0.09），4 组SRC处理对土壤的酸化均有调节作用，其中施入10%SRC 对土壤酸碱度改良效果最为显著（6.60 ± 0.54）。从重金属上看，SRC 效果显著，1% SRC 的施入量就可显著降低土壤中Cd 的含量。低浓度的SRC（1%～5%）施入对一些重金属含量的降低效果并不理想，甚至使有些重金属含量升高；说明必须要较高浓度的SRC 施入量才可改良土壤的重金属含量，然而，高浓度的SRC 施入（20%SRC）并不能有效降低Hg含量。同时，发现土壤的pH 值并不能随着SRC 浓度的升高而升高，例如，20% SRC 施入量的土壤pH值低于10% SRC 施入量的土壤pH 值。这一结果与前人的研究相似，陈云峰等[15]在研究SRC 对蔬菜种植土壤酸性改良中，发现土壤pH 值提升效果与施用量并不存在正相关关系。因此，认为高浓度的SRC施入（＞10%）对茶园土壤有一定的改良作用。

表 1 室内SRC 处理对土壤pH 值及重金属含量的影响Table 1 Effects of SRC on pH and heavy metals in pot soil

2.2 SRC 对室内盆栽茶树土壤细菌多样性的影响

通过高通量测序数据，共得到802 020 条有效序列，其中2017 年室内种植茶树的土壤的平均有效数据为42 289，2018 年室内种植茶树土壤的平均有效 数 据 为44 959，4 个 处 理 组20%SRC、10%SRC、5%SRC 和1%SRC 的土壤样本平均有效数据分别是41 032、46 179、49 355 以及43 525。经过数据库比对分析及注释后，基于QIIME 软件，对物种进行了OUT 聚类。结果显示，20%SRC 处理组OTU 数最大

（1033.7），CK2017 对照组最小（911.7），且两组OTU数目差异显著，表明SRC 对于土壤细菌的物种数目具有显著影响。进一步对土壤细菌群落丰度指数（Chao1、ACE）以及多样性指数（Shannon、Simpson）进行调查，结果显示，施用SRC 可一定程度上增加土壤细菌的种群丰度，但差异不显著（表2）。

表 2 室内SRC 处理对土壤细菌多样性的影响Table 2 Effects of SRC on microbial diversity in pot soil

2.3 SRC 对室内茶树种植土壤细菌群落组成与结构的影响

在门水平上，对照组与SRC 处理组中的优势菌群 均 为 变 形 菌 门（Proteobacteria）、 绿 弯 菌 门（Choroflexi）以及放线菌门（Actinobacteria）。然而，结果显示，茶树的种植可影响土壤细菌群落组成和结构。相较于2017 年，种植一年茶树后，其土壤变形菌门和绿弯菌门的比例升高，但是放线菌门的比例却明显降低（图1-A）。SRC 处理后，这些优势菌群的结构也发生了明显的改变。土壤中的变形菌门比例降低，绿弯菌门的比例升高，且放线菌门的比例也发生了波动（图1-A）；此外，各SRC 处理组土壤中蓝藻菌（Cyanobacteria）比例下降明显，5%SRC、10%SRC 和20%SRC 处理组尤为显著，比例均在1%以下（对照为3.3%）。对丰度前5%的细菌群落，在属水平对群落组成结构进行PCA 分析（图1-B），结果表明，SRC 处理组土壤细菌的群落组成与对照组的差异较大。

图 1 室内SRC 处理土壤细菌群落种类分布及主成分分析Fig. 1 PCA on species distribution of microbial community in pot soils

基于非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）评价不同土壤样本之间的相似度。发现10%SRC 处理组土壤细菌群落组成聚为一类（图2）。同时，聚类分析也发现了1%SRC 处理的土壤重复之间差异较大，这一结果与上述PCA 结果相同，说明1%SRC 处理所取土壤样本细菌不均一，后续研究可通过增加重复数目来进行改良。

图 2 基于UPGMA 算法的土壤细菌聚类分析Fig. 2 UPGMA-based cluster analysis on soil microbes

2.4 SRC 对茶园土壤pH 及重金属的改良

结果显示，一年内茶树种植对茶园土壤的影响并不显著，土壤酸化或者重金属的含量变化不明显（表3）。然而，SRC 却可以在短时间内影响茶园土壤，例如，SRC 可以在一年内明显改良土壤酸化，使土壤pH 值显著上升（表3）；对重金属的改良也作用明显，结果显示，施用SRC 后，8 种土壤重金属含量均显著下降（表3），显示了SRC 对茶园土壤改良的潜力。

2.5 SRC 对茶园土壤细菌群落组成与结构的影响

SRC 处理后的茶园土壤细菌丰富度上升显著（表4）。从土壤细菌种类在门水平的分布上看（图3），土壤细菌分布比例最高为变形菌（Proteobacteria），两组对照（2018 和2019）土壤中变形菌比例均高于55%，分别为57.8%和55.5%，但在SRC 处理组中，这一比例降为45.1%（图3-A）。相比两个不同时间段的对照土样CK2018 和CK2019，SRC 处理组中酸杆菌（Acidobacteria）和厚壁菌（Firmicutes）比例同样下降明显。相反，拟杆菌（Bacteroidetes）和绿弯菌（Chloroflexi）比例上升显著，分别达到9.6%和11.3%。属水平的PCA 主成分分析结果表明，SRC处理组土壤细菌群落结果与对照组差异显著（图3-B）。

图 3 茶园SRC 处理土壤细菌群落种类分布及主成分分析（PCA）Fig. 3 PCA on species distribution of microbial community in soils at tea plantations

表 3 SRC 处理对茶园土壤pH 值和重金属含量的影响Table 3 Effects of SRC on pH and heavy metals in soils at tea plantations

表 4 SRC 处理对茶园土壤细菌多样性的影响Table 4 Effects of SRC on microbial diversity in soils at tea plantations

3 讨论与结论

在不施肥的前提下，大田和盆栽试验均表明SRC 能明显提升土壤pH，说明SRC 对于提升茶树种植土壤pH 的效果较稳定，对土壤pH 的提升效果不随施用方式不同而波动。SRC 是一种火成岩，有害元素较低、碱性较强，磷、硅、钙、钾及微量元素较高，能对土壤酸度起到一定的中和作用[14−16]。盆栽试验中的SRC 与土壤混合均匀，而大田试验中，本研究采取的是常用的条施方法，施用深度在20 cm左右。此外，盆栽试验说明，SRC 对土壤pH 的提升效果不与SRC 施用浓度呈正比，10%SRC 对土壤pH 提升效果最好，这与陈云峰等[15]、James 等[17]的研究结果一致。且SRC 对于土壤酸化的改良效果已在其他多种经济作物上被验证，如在芦笋、大麦等[15]。综上所述，对于茶园土壤逐年酸化严重的问题，可以通过补施SRC 来快速缓解土壤酸化问题。

本研究结果表明，茶园土壤中富集最多的重金属为锌和铜。根据颜明娟等[18]的调查显示，福建地区锌含量有超标现象。此外，叶琛等[19]发现，土壤中的铜、铬、镉含量与茶叶重金属含量具有较强的相关性。盆栽与大田试验发现，添加SRC 对重金属污染的改良有一定的效果，盆栽试验表明低浓度SRC 的施入量就可显著降低土壤中Cd 含量，然而，低浓度的SRC（＜10%）对于其他重金属含量的降低效果并不显著。因此，可通过增加碳酸盐岩施用量来解决这一问题。因此，本研究用大剂量的SRC 施用量来进行大田试验（1 120 kg·hm−2左右），结果表明大剂量SRC 的施用可显著降低8 大重金属的含量。

微生物生物群落数量和活性是影响土壤肥力的重要因素[20]，而土壤酸化可严重影响土壤微生物群落、结构，导致有益微生物种群大量减少，不利于茶园土壤中养分的转化[21]。部分研究学者提出细菌可分为富营养菌和寡营养菌[22−23]，例如，酸杆菌门多生长于营养贫瘠的土壤环境中，因此属于寡营养细菌[23]。本研究发现，相较于未施用SRC 的茶园，施用SRC 的处理土壤中的酸杆菌门的相对丰度显著下降，这也说明施用SRC 可提高土壤养分。

综上所述，在茶园内施用碳酸盐岩（SRC）可以降低土壤酸性、改良土壤重金属污染，提高茶园土壤养分。