圆齿野鸦椿果皮总三萜的提取工艺及其抗肿瘤活性△

姚秋娟，冯翯，王玉启，范琳俐，金航，黄维，2*，邹小兴*

1.福建农林大学 生命科学学院，福建 福州 350007；2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350007；3.福建农林大学 林学院，福建 福州 350007

省沽油科野鸦椿属的圆齿野鸦椿EuscaphiskonishiiHayata是我国特有的常绿小乔木，主要分布在福建、广东、海南等东南地区，喜生于海拔1000 m左右的山谷或疏林中[1-2]。圆齿野鸦椿是福建的民间传统药材，其果实温中理气，可止痛消肿，常用于治疗胃痛、泻痢、脱肛、睾丸肿痛等[3-4]。其果皮中主要含有三萜[5]、黄酮[6]、酚酸类[5-7]等成分，有抗炎、保肝和抗癌等疗效[8-10]。三萜类化合物在自然界中广泛分布，具有抗肿瘤、抗炎、降血糖、调血脂[11-14]等活性，开发前景良好。本研究以超声波法提取圆齿野鸦椿果皮总三萜，利用响应面法优化提取工艺，同时在果皮总三萜抵抗肿瘤活性方面做了考察，为今后圆齿野鸦椿药用资源开发和利用研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

HERAcell 240i型二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma)；UV-2700型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；BS-210S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；BC-W201型恒温水浴锅(上海贝凯生物化工设备有限公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE52CS-2型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；Millipore Synergy-UV超纯水机(美国密理博公司)；101A-0型数显式电热恒温干燥箱(上海阳兴试验仪器有限公司)；TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药

RPMI 1640 培养液、DMEM从培养液、青链双抗、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶溶液(Hyclone 公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司，批号：MKBP6836V)；齐墩果酸(阿拉丁公司，批号：11354215)；香草醛、冰乙酸、无水乙醇、二甲基亚砜及其余试剂均为分析纯。

圆齿野鸦椿于2018年10月采自福建省邵武市天成岩，经福建农林大学研究员邹双全鉴定为省沽油科野鸦椿属圆齿野鸦椿EuscaphiskonishiiHayata，其果实晒干后分离果皮和种子，将果皮粉碎成粉，并过50目筛备用。

1.3 细胞株

肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7和结肠癌细胞HCT-116均购自上海中科院细胞库。

2 方法

2.1 圆齿野鸦椿果皮总三萜的提取

称取圆齿野鸦椿干粉1.0 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，根据实验设计方案，按不同的液料比和不同体积分数乙醇溶液混合后，加入超声波容器中，以设定的功率提取相应的时间，获得不同条件下的圆齿野鸦椿果皮总三萜提取液。

2.2 单因素试验和响应面试验

根据条件设计单因素试验，如液料比10∶1～60∶1、提取时间30～120 min、乙醇体积分数40%～80%、超声功率100～500 W分别进行试验，考察上述因素对圆齿野鸦椿果皮总三萜提取率的影响。根据中心组合原理，以四因素三水平响应面设计试验，用Design-Expert V8.0.6软件进行优化。

2.3 三萜含量测定

齐墩果酸经过105 ℃干燥处理后，称量20 mg，用无水乙醇温热溶解到100 mL的烧杯中，冷却至常温，无水乙醇定容于100 mL量瓶。分别加0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL齐墩果酸对照品溶液于6个试管，80 ℃水浴挥干，加0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1 mL高氯酸，60 ℃水浴反应20 min，冰浴10 min后用10 mL冰乙酸稀释，于波长540 nm处测定吸光度(A)值[14]，获得标准曲线方程：Y=0.600 1X-0.017 2 (r=0.998 6)，X为齐墩果酸对照品的质量浓度(μg·mL-1)，Y为A540 nm。

2.4 圆齿野鸦椿总三萜的纯化

果皮提取物浓缩后利用硅胶柱进行分离纯化，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮及三氯甲烷-甲醇进行分离洗脱，以乙酸酐-浓硫酸(Liebermann-Burchard)试剂进行检测[15]，收集洗脱液进行减压浓缩和干燥。

2.5 圆齿野鸦椿果皮总三萜抗肿瘤活性测定

2.5.1细胞培养 在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养A549、HepG2、HCT-116和MCF-7细胞，A549和HepG2细胞采用DMEM培养基，HCT-116和MCF-7细胞采用RPMI 1640培养液，上述2种培养基中均含有胎牛血清(体积分数为10%)、青霉素(1×105IU·L-1)和链霉素(100 mg·L-1)，取对数生长期细胞用于实验。

2.5.2MTT法测定药物的半数抑制浓度(IC50) 96孔板中每孔180 μL种5×103个细胞，设置果皮总三萜不同给药浓度，于37 ℃培养箱48 h后加20 μL的MTT，再培养4 h，加 DMSO溶解甲瓒，在570 nm波长下测A值，按公式(1)计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率=(A对照-A实验)/(A对照-A空白)×100%

(1)

2.6 统计学处理

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1液料比对总三萜提取率的影响 称取1.0 g果皮粉末，分别按液料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL·g-1加入60%乙醇溶液，在温度50 ℃和超声功率300 W的条件下，超声提取1 h。如图1 所示，总三萜提取率在液料比为30∶1时达到最大值，当液料比>30∶1时，提取率开始下降，这可能与液料比引起细胞外渗透压的变化有关。

图1 液料比对圆齿野鸦椿总三萜提取率的影响

3.1.2提取时间对总三萜提取率的影响 称取1.0 g果皮粉末，在超声波功率300 W、液料比30∶1和提取温度50 ℃的条件下，加入60%乙醇，超声提取45、60、75、90、105、120 min。如图2所示，提取时间为75 min时总三萜提取率最大，75 min后总三萜提取率略有下降，可能是因为提取时间过长，超声波会破坏三萜化合物结构。后续实验的提取时间为75 min。

图2 提取时间对圆齿野鸦椿总三萜提取率的影响

3.1.3乙醇体积分数对总三萜提取率的影响 称取1.0 g果皮粉末，在液料比为30∶1、提取温度为50 ℃和超声波功率为300 W条件下，依次加入体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，超声提取75 min。如图3所示，圆齿野鸦椿果皮总三萜提取率从乙醇体积分数30%～60%时显著上升，60%和70%的乙醇提取率差异无统计学意义，而80%乙醇提取率略有下降(P<0.05)，可能与圆齿野鸦椿果皮总三萜的极性有关，同时基于溶剂成本考虑，选择60%乙醇作为下一步圆齿野鸦椿果皮总三萜的提取溶剂。

图3 乙醇体积分数对圆齿野鸦椿总三萜提取率的影响

3.1.4超声波功率对总三萜提取率的影响 称取1.0 g果皮粉末，在液料比为30∶1、提取温度为50 ℃和提取溶液为60%乙醇的条件下，以250、300、350、400、450、500 W超声波功率超声提取75 min。如图4所示，圆齿野鸦椿果皮总三萜提取率从功率为250～350 W显著上升，提取率在400 W时达到最高，>400 W提取率开始下降，可能过大的功率会造成总三萜结构的改变。

图4 超声波功率对圆齿野鸦椿总三萜提取率的影响

3.2 响应面法优化结果和分析

3.2.1回归模型 拟合以单因素试验为基础，结合中心组合设计原理，将液料比(A)、提取时间(B)、乙醇体积分数(C)、超声波功率(D)设为自变量，因变量(Y)为圆齿野鸦椿果皮总三萜提取率，用代码-1、0、1来表示每个因素的3个水平(见表1)，结果见表2。

表1 响应曲面试验设计因素水平

表2 响应面分析方案及结果

采用Design-Expert V8.0.6软件对表2的数据进行响应面分析，以圆齿野鸦椿总三萜提取率为响应值，对各因素进行线性模型拟合，得到多元二次回归模型方程：Y=9.63+0.17A-0.097B-0.030C-0.053D-0.41AB-0.25AC+0.23AD+0.85BC+0.43BD-0.048CD-0.70A2-0.72B2-0.61C2-0.16D2(r=0.984 2)。通过二次模型及其回归系数的方差分析来检验该模型的有效性，结果见表3。

表3 回归模型方差分析

该模型P<0.000 1，失拟项P=0.923 4>0.05，表明模型与实际拟合较好，可以用来预测果皮总三萜提取率并优化其提取工艺。由F值可得出各因素实验结果的影响力为液料比>提取时间>超声波功率>乙醇体积分数。

3.2.2响应面工艺优化分析 从A、B、C、D的交互作用响应面的陡峭情况可以看出AB、AC、BC三者的相互作用对圆齿野鸦椿总三萜提取率均具有较大影响(见图5)。通过Design Expert V8.0.6分析圆齿野鸦椿果皮总三萜最佳工艺条件为液料比34.91∶1，提取时间为70.16 min，乙醇体积分数为66.73%，超声功率为378.10 W，该条件下总三萜提取率达到9.63%。根据实验条件调整，将液料比35∶1、提取时间70 min、乙醇体积分数67%和超声功率为400 W确定为最佳工艺提取条件。进行3次验证实验后，得到圆齿野鸦椿果皮总三萜提取率平均值为(9.63±0.06)%，与理论值一致且重复性好，说明此响应面法得出的回归模型较可靠。

图5 两因素相互作用对圆齿野鸦椿果皮总三萜提取率的响应面图

3.3 圆齿野鸦椿果皮总三萜的抗肿瘤活性

果皮提取物浓缩后利用硅胶柱分离纯化和浓缩干燥，得到圆齿野鸦椿果皮总三萜。用DMSO溶解总三萜后，用不含血清的培养基稀释成不同的浓度，分别处理HepG2、A549、HCT-116和MCF-7细胞48 h，MTT法测细胞存活率并作细胞生长抑制率图，采用SPSS 22.0软件求出圆齿野鸦椿果皮总三萜的IC50。结果表明，圆齿野鸦椿果皮总三萜对HepG2、A549、HCT-116和MCF-7均有明显的增殖抑制作用，其IC50分别为(90.38±0.96)、(87.56±1.35)、(86.95±1.64)、(97.30±1.27)μg·mL-1，体现了良好的抗肿瘤活性，见图6。

图6 圆齿野鸦椿总三萜对肿瘤细胞增殖的影响

4 讨论

响应面法结合多元二次回归方程拟合各因素与响应值间的函数关系，建立多维空间曲面，通过评价生物影响因子及其交互作用得出最佳水平，这是高效的统计学方法[15]。本实验以单因素考察为基础，利用响应面法优化了总三萜的提取工艺，并确定液料比35∶1、提取时间70 min、乙醇体积分数67%和超声功率为400 W为最佳提取工艺条件，此条件下得到的理论提取物中总三萜提取率为9.63%，并进行了3次验证，得到圆齿野鸦椿果皮总三萜提取率平均值为(9.63±0.06)%，与理论值一致，说明响应面法优化得出的提取工艺有一定参考价值。

恶性肿瘤极大地威胁了人类的健康，所以寻找有效治疗抗肿瘤药物是世界医学研究面临的重要课题。近年来，一些传统的药用植物在肿瘤预防和治疗中显示了良好的疗效，这让人们开始去关注和了解[16]。三萜类在植物中普遍存在，有很强药理活性，属于次级代谢产物，可应用在抗肿瘤药物的开发和利用[17-19]。课题组在前期研究中发现，圆齿野鸦椿果皮醇提物治疗恶性肿瘤有一定效果[9]，但其中的抗肿瘤活性成分还未进行进一步的分析。本研究通过对圆齿野鸦椿果皮总三萜进行制备和抗肿瘤活性评价，其结果显示，圆齿野鸦椿果皮总三萜对肝癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞均具有良好的增殖抑制活性，有较好的开发应用前景。