高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中喹乙醇的不确定度评估

杨彦宁，欧海军，谭美英，隆雪明，周灿，陈福华

（湖南省兽药饲料监察所，长沙410000）

随着“造肉1号“味霸”“速肥肽”等非法饲料添加剂的曝光，“喹乙醇”逐步进入公众视野。这种被称为“新型瘦肉精”的药物，是1965年由德国人合成的一种抗菌助生长剂[1]，具有蛋白同化作用，可提高饲料转化率与瘦肉率，促进动物生长。但大剂量的使用喹乙醇会对动物产生毒性作用[2]。喹乙醇在体内具有一定蓄积性，可对动物或人产生致畸、致癌、致突变[3]。欧洲和美国已经禁止喹乙醇作为饲料添加剂使用。我国农业农村部第2638号公告也明确表示，由于喹乙醇兽药的原料药及各种制剂可能对动物产品质量安全、公共卫生安全和生态安全存在风险隐患，根据《兽药管理条例》第六十九条规定，决定停止在食品动物中使用喹乙醇。因此，喹乙醇检测结果的准确性在保障动物源性食品安全和公共卫生安全，确保养殖环节依法、科学、合理用药，为兽药执法监管工作的有效开展提供有力的支撑时显得尤为重要。

本文采用高效液相色谱-串联质谱测定饲料中喹乙醇，采用JJF-1059-2012《测量不确定度评定与表示》、JJF1135-2005《化学分析测量不确定评定》、CNAS-GL006-2019《化学分析中不确定度评估指南》等对结果进行不确定度评估，对不确定度各分量进行计算，探究影响检测结果不确定度的影响因素，为评定检测结果的准确性提供参考[4-9]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱（AB 3200Q Trap）：配有电喷雾离子源（ESI），固相萃取装置，喹乙醇标准品（Dr），HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL），甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯）。

1.2 检测方法

依据农业部2086号公告-5-2014《饲料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的测定液相色谱-串联质谱法》进行检测。

1.3 样品制备

准确称量预混合饲料1 g（精确至0.01 g），加入0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL，涡旋1 min，40℃超声波清洗仪中超声10 min，9 000 r·min-1离心15 min，收集上清液。残渣用0.1%甲酸-乙腈溶液10 mL重复提取1次，合并提取液，混匀，准确量取5.0 mL总提取液于10 mL试管中，60℃氮气吹至约2 mL，加入0.1 mol·L-1磷酸二氢钾溶液，充分溶解残余物，为备用液。转移至已活化的HLB固相萃取柱，待试样完全通过固相萃取柱后用0.02 mol·L-1盐酸3 mL和5%甲醇3 mL淋洗，挤干，用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液并氮气吹干，用20%乙腈溶液1 mL充分溶解，过0.22μm滤膜后上高效液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）检测。

1.4 仪器条件

1.4.1色谱条件

色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm 1.7μm），柱温为40℃；进样体积10μL流速为0.5 mL·min-1，流动相A乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液，梯度为0～0.5 min，体积分数为5%的B溶液；0.5～4 min，体积分数为5%～90%的B溶液，4～6 min，体积分数为90%的B溶液，6～7 min，体积分数为90%～5%的B溶液。

1.4.2质谱条件

离子化模式为电喷雾正离子模式，质谱扫描方式为MRM，离子源温度为600℃、碰撞能量及定性定量离子质谱参数如表1所示。

表1喹乙醇质谱参数及保留时间

2 结果与讨论

2.1 数学模型

采用外标法定量，按下式计算喹乙醇含量：

式中，X为样品中待测组分含量（mg·kg-1）；C被测样品浓度（μg·mL-1）；V1提取液定容体积；V2用于SPE净化的提取液体积，5 mL；V3最终上机的浓缩液体积，1 mL；m样品质量（g）。上述公式依据样品测定原理给出，未考虑随机因素对测量结果的影响。

2.2 不确定度来源

根据检测过程和喹乙醇含量的计算公式，得到不确定度来源图，见图1。

2.3 各分量标准不确定度的评估

2.3.1测量重复性的相对标准不确定度

由于分析过程中，很多操作引入的不确定度具有一定的重复性，如天平称量，移液管转移液体，容量瓶定容体积，回收率等操作等，因此，可以将此类分量进行归纳，引入重复性，即精密度，用于分析研究过程中随机变化引入的不确定度。精密度主要采用统计学方式进行研究，对加标样品中喹乙醇含量进行一系列平行测试，得到分析过程总随机变化，以该标准化差值的标准偏差评估试验过程的重复性不确定度。

在重复性条件下，对同一加标样品中喹乙醇的含量进行独立8次测量，结果见表2，综合上述数据，按照贝塞尔公式计算测量结果的标准差，单次测量的标准不确定度为：

其算数平均值的标准不确定度为：

重复条件下，喹乙醇含量的相对标准不确定度为：

上述分量合并研究各种随机因素，如体积读数偏差、LC-MS/MS变动，样品混合不均匀以及HLB固相萃取小柱对回收率的影响等，后续评定其他分量时，不再考虑各种随机因素。

2.3.2试样称量引入的不确定度

试样称量引入的不确定度主要是天平的校准，允许误差±0.001 g，假定为均匀分布，其标准不确定度为：

预混合饲料1 g，则其相对标准不确定度为：

2.3.3提取液V1引入的不确定度

用10 mL单标吸管吸取10 mL 0.1%甲酸-乙腈提取液，根据检定规程JJG196-2006[8]，10 mL A级吸管允许误差为±0.02 mL，假定为三角分布，则10 mL的单标吸管的相对标准不确定度为：

由于方法中，需重复提取1次，两次移取独立不相关，因此，提取液引入的不确定度合成得：

图1喹乙醇检测过程中不确定度来源

表2加标饲料中喹乙醇含量mg kg-1

2.3.4净化液V2引入的不确定度

从提取液中量取5.0 mL待氮吹、净化，根据检定规程JJG196-2006，5 mL A级单标吸管允许误差为±0.015 mL，假定为三角分布，则5 mL单标吸管的相对标准不确定度为：

2.3.5用于测定样品定容体积V3引入的不确定度

用1 mL的单标吸管量取20%乙腈溶液充分溶解已吹干试样，根据检定规程JJG196-2006，1 mL A级单标吸管的允许误差为±0.007 mL，假定为三角分布，1 mL的单标吸管的相对标准不确定度为：

2.3.6标准品引入的不确定度

标准品纯度引入的不确定度：方法中采用的喹乙醇标准品，纯度为97.89%，根据证书提供的不确定度为0.73%，假定均匀分布，则其不确定度为：

标准品称量引入的不确定度：准确称量标准品喹乙醇8.523 85 g，称量时使用分辨率0.000 01 g分析天平，由2.3.2可知，其相对标准不确定度为：

标准储备液定容引入的不确定度：标准品用甲醇定容至10 mL，使用容量瓶为10 mL A级，根据检定规程JJG196-2006，10 mL A级容量瓶的允许误差为±0.02 mL，假定为三角分布，则10 mL的容量瓶的标准不确定度为：

综上，在标准液配制时引入的不确定度由上述三种合成，即

使用标准溶液因温度变动引起的标准溶液浓度不确定度：室温（20±5℃），甲醇的膨胀系数为1.1×10-3/℃，则由温度引起的体积变化为±5×1.1×10-3=±0.005 05 mL，假定均匀分布，则：u（T）=标准品引入的不确定度由以上不确定度合成，由标准溶液引入的不确定度为：

2.3.7测定液引入的不确定度

本次人工配制浓度为0.834 4 mg·mL-1喹乙醇储备液，稀释为62.58、104.3、208.6、417.2、834.4 ng·mL-1标准系列，引入不确定度，校正曲线为Ai=a+bCi，由工作曲线变动性引起浓度c的标准不确定度分量为：校正曲线各个参数如表3所示。

表3校正曲线参数

2.4 合成标准不确定度

2.4.1相对不确定度

各分量的相对标准不确定度见表4。

表4相对不确定度各分量

按照评定不确定度的测量模型计算喹乙醇含量的合成不确定度，

本次测定，样品中喹乙醇为0.763 mg·kg-1，则

2.4.2扩展不确定度

根据国际惯例95%置信概率取包含因子K=2，则扩展不确定度为u（x）=k×u=2×0.012 2=0.024 4 mg·kg-1。

2.5 检测结果的表示

用液相色谱-串联质谱测定饲料中喹乙醇，结果表示为（0.763±0.0244）mg·kg-1，其中扩展系数为k=2。

3 结果分析

由相对不确定度直方图（见图2）可以看出，对喹乙醇结果影响最大的是urel（V1），即提取液的体积，其次是重复性操作urel（fr）及标准溶液的配制urel（s），因此，在对饲料中喹乙醇含量进行检测时，应尽量确保提取液体积移取准确，标准溶液配制及稀释精准，在条件允许情况下，多作平行样，保证重复性操作的规范性，消除系统误差影响。

图2相对不确定度直方图

4 结论

通过分析高效液相色谱-串联质谱测定饲料中喹乙醇不确定度来源，对各不确定度分量进行计算，得出当饲料中喹乙醇含量为0.763 mg·kg-1时，其扩展不确定度为0.0244 mg·kg-1（k=2）。通过对其中不确定分量进行分析发现，影响检测结果的主要因素是提取液体积、重复性操作、以及标准品的配制与稀释，因此，在实际检测中，应严格控制试验条件，保证移液管等规范使用，标准溶液配制准确无误，也应加强检验人员岗位培训，确保试验过程规范性和重现性，减小此类不确定度分量对检测结果带来的影响，也为饲料质量安全控制提供有效、可靠、可溯源的测量数据。