荧光PCR检测技术对非洲猪瘟的常规监测

马成立

（辽宁省葫芦岛市建昌县动物疫病预防控制中心 125300）

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性，高度接触性的传染病。发病率和死亡率可达100%。世界卫生组织将其列为法定报告的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。该病虽然不是人畜共患病，无公共健康危害，但由于目前无有效的疫苗和治疗方法，任其流行会给养猪业带来巨大的经济损失，造成严重的社会影响，冲击畜产品国际贸易。我国是世界第一养猪大国，饲养量占世界总量的50%左右，切实做好非洲猪瘟病毒防控工作事关我国养猪业持续健康发展。

利用实时荧光PCR 定性检测是否存在非洲猪瘟病毒，对早期监测，防控非洲猪瘟具有重要的指导意义。

在实际工作中，我们首先选择洛阳莱普生信息科技有限公司生产的核酸提取试剂盒和核酸检测试剂盒来进行非洲猪瘟病毒检测实验，效果非常好。

在实验过程中，我们需要准备的仪器设备有数显恒温水浴锅、高速冷冻离心机、生物安全柜、移液器等，还需自备无水乙醇。

被检样品是动物组织，应保存于50%甘油生理盐水中，然后取样约1g，用手术剪剪碎，于研钵中加入生理盐水继续研磨，混匀，后转移至1.5ml 的灭菌离心管中，离心待用。如果是血液或全血样品，则使用离心机离心析出血清后置于1.5ml灭菌离心管中待用。环境样品则保存于病毒收集管中，离心后取上清液置于1.5ml 灭菌离心管中待用。

无论何种样品，实验开始前都要在数显恒温水浴锅中进行60℃的病毒灭活。

实验开始时首先要提取样品核酸。采用柱状提取法，因采用的离心吸附柱可以特异性的结合核糖核酸或脱氧核糖核酸，加之独特的缓冲液A，缓冲液B，缓冲液C，提取的核酸纯度高，质量稳定可靠。在试剂盒配备的缓冲液C 瓶中一定要先加入4 倍体积的无水乙醇，混匀后做好标记，备用。

1 核酸提取

（1）取已处理好的待检样品，在已开机的生物安全柜中吸取200μl 上清液加入1.5ml 的相对应的灭菌离心管中，做好标记，然后分别加入600μl 的缓冲液A，温和的上下颠倒混匀6～8 次，室温静置5min；2～8℃下用高速冷冻离心机5000r 离心1～2min，用移液器取400μl 的上清液转入新的灭菌离心管中。

（2）加入200μl 的无水乙醇，立即上下颠倒混匀，全部转入已做好对应标记的吸附柱中，静止2min，2～8℃下12000r 离心30～60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（3）向吸附柱中加入500μl 的缓冲液B，室温下静止2min，2～8℃下12000r 离心30～60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（4）向吸附柱中加入700μl 的缓冲液C，2～8℃下12000r 离心30～60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（5）2～8℃下12000r 离心2min，去除吸附柱中残留的液体。

（6）将吸附柱置于对应的干净的灭菌离心管中，开盖晾干3～5min，向吸附膜的中间部位悬空滴加60μl 的洗脱液，室温放置2min。

（7）室温下12000r 离心1min，离心管中的液体即为提取的核酸。-20℃保存或直接进行下一步实验。

注意事项：实验前应准备好盛有消毒液的容器，以便放置实验过程中的垃圾，实验人员必须经过专业培训才可上岗，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不得交叉使用，各区间人员流动及空气流向应有严格要求。

2 核酸检测

该检测试剂盒检测原理是针对非洲猪瘟病毒高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含有非洲猪瘟病毒基因组模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR 过程中相应通道的荧光信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。该试剂盒主要组成成分有：扩增反应液1 管，阴性对照1 管，阳性对照1 管，说明书1 份。

实验前20min 将试剂盒从-20℃的冰柜中取出，以平衡至室温25℃，并使试剂完全溶解。

（1）按照需要检测的样本数加上阴性对照数和阳性对照数，取出PCR 反应管，按每管17.5μl 的用量分装到PCR 反应管中。

（2）加入待检样本提取的核酸，每管加入2.5μl，阴性对照和阳性对照管也加入2.5μl，记录加样顺序。

（3）盖好PCR 反应管盖，将PCR 反应液与样本核酸震荡混匀后2000r 离心10s。以上实验步骤均在核酸提取室进行。

（4）将PCR 反应管转移到核酸扩增区，准备上机进行核酸扩增。

（5）开机预热并检验仪器性能。

（6）取准备好的PCR 反应管，放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序。

（7）按照样品槽上样品位置，在仪器上进行样品布局。

（8）设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR 扩增：反应体系设为20μl，95℃30s，一个循环；95℃5s，60℃40s，40 个循环。在FAM 通道采集荧光信号，ABI 系列荧光定量PCR 仪不选ROX 校正，淬灭基团选None，然后进行核酸扩增。

3 结果分析

（1）结果分析条件设定：阈值设定原则是合理调整阈值线，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。

（2）试剂盒中的阳性对照Ct 值小于或等于30，有明显指数增长，呈典型的“S” 形曲线。阴性对照Ct 值大于38 或无Ct 值，线形为直线或轻微斜线，无明显指数增长期和平台期，则该试剂盒具有有效性。

（3）实验结果：如果样品检测结果Ct 值小于或等于35，有明显指数增长，表明该样品中检测出该病毒。如果样品检测结果Ct 值在35～38 范围，为可疑，此时应对样品进行重复检测，如果重检结果Ct 值仍在35～38 之间，有明显指数增长，则判定该样品是阳性，否则为阴性。如果被检样品检测结果Ct 值大于38 或无Ct 值，表明该样品中没有检测出该病毒，为阴性，结果分析后要保存当前的分析结果，记录好阈值。

4 注意事项

实验室管理应严格按照国家有关临床基因扩增实验室的管理规范执行。实验前仔细阅读试剂盒说明书，严格按照操作步骤进行，避免导致错误结果。实验过程要分区进行，分别在试剂准备室，核酸提取室，扩增反应室进行。实验操作的每个阶段使用的仪器和设备必须专用，不得交叉使用。所有试剂均应在规定的温度储存，冷冻保存的各试剂使用前应完全融化，8000r 离心15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器枪头尽量在液体表面层吸取，使用后立即放回冰柜，冷冻保存。使用不含荧光物质的一次性手套，实验过程中经常替换手套，预防交叉污染。操作过程中吸取液体，设定时间等全部过程必须精确。为防止荧光干扰，不要在PCR 反应管上做任何标记，并避免用手直接接触。实验过程中产生的废弃物及试剂盒内试剂组分在实验中均按照具有潜在传染性物质处理方法进行处理。操作台面，离心机，生物安全柜，移液器等仪器用品在实验结束后必须用消毒液进行擦拭消毒或浸泡消毒，实验房间在实验结束后用紫外线灯进行消毒处理。被检样品在采集、储存、运输及核酸提取过程中操作方法不当，容易造成核酸降解而产生假阴性结果，当被检样品核酸浓度过低时也可能产生假阴性结果。被检样品在采集和制备过程中如果发生交叉污染，容易产生假阳性结果。