鸡传染性喉气管炎和新城疫病毒双重PCR检测方法的建立

戴娜桑

（福建省南安市动物疫病预防控制中心 362300）

鸡传染性喉气管炎 （Avian Infectious Laryngotracheitis，AILT）及鸡新城疫(Newcastle disease，ND) 在临床中有极为接近的表现症状的鸡呼吸道疾病，对于养殖业有重大危害，造成大量鸡只死亡，造成养殖行业巨大的经济损失。这两种病毒的感染性极强、致死率极高，对不能年龄段的鸡群造成感染，而鸡群感染后的症状接近，常出现一种或两种病源混合感染，给病毒治疗和预防带来极大困难[1]。本文以鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒的基因保守序列为基础，进行2 对特异性引物及2 条非一致荧光基团标记的TaqMan 探针设计与试验，优化和调整了反应条件后，建立鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒双重PCR 检测方法。

1 材料以及方法

1.1 材料

主要材料包括鸡传染性喉气管炎病毒LaSola 株、鸡新城疫病毒H120 株、禽流感病毒(AIV)、鸡白血病病毒(ALV) 等鸡类常见病毒，全部由实验室进行保存。以及一步法荧光RT.PCR 反应试剂、病毒RNA 抽提试剂盒。

1.2 方法

引物的设计及合成：以鸡新城疫病毒的NP 基因及鸡传染性喉气管炎病毒的N 基因保守序列，使用Primer Express3.0 软件进行设计，成功设计出2 对特异性引物及2 条TaqMan 探针。

敏感性检测：把质粒PAILT 及pNDV.NP 进行混合，以10倍稀释为1×101拷贝/μL～1×107拷贝/μL，以帮助实施双重荧光RT.PCR 实验，一共进行8 次试验，试验结果和常规PCR 检验对比。

2 结果

特异性检测：将cDNA 作为本次特异性实验的研究模板，其是通过鸡新城疫病毒的基因组RNA 的反转性录入所得出，在模板中添加针对鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒的引物、探针来对其实施RT.PCR 试验，采集所有检验孔的FAM 与JOE 信号，通过采集结果得出这一方法的引物及探针在两种病毒中的特异性。对鸡传染性喉气管炎病毒也实施相同方法进行特异性试验。

重复性检测：用本次所构建的双重PCR 检验方法对鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭瘟病毒、禽流感病毒、伪狂犬病毒、正常鸡胚和正常鸡器官进行3 次重复试验，确定本次研究构建的双重PCR 检验方法的重复性及稳定性。

样品试验：本次研究选取了在各个地区收集的150 份鸡新城疫、鸡传染性喉气管炎的疑似鸡病料，并使用建立的双重PCR 检测方法进行检验，对得出的增产物实施序鉴定，使用生物学软件对鉴定结果进行分析。

3 结果

灵敏度试验结果：鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒双重PCR 检测方法的灵敏度都为10 拷贝/L，对比常规的PCR检测方法灵敏度提高100 倍，经过多次重复，检验结果均相同。此外，检验的CT 值和常规检验方法对比，其CT 值无明显差异，均为4%之下。

特异性试验结果：在反应体系内单纯添加鸡新城疫病毒或鸡传染性喉气管炎的核酸当作模板，再后续添加鸡新城疫病毒或鸡传染性喉气管炎的引物及探针所进行PCR 定量检验之中，结果只有对应病毒的特异性曲线，试验证明本次研究涉及的引物和探针都具备较强特异性。

稳定性试验结果：在稳定性试验中，一共进行3 次重复检验，所得结果相同，表明该次研究所建立的PCR 双重检验方法具备良好的重复性及稳定性

样品试验结果：使用所建立的双重PCR 检测方法对150 份疑似鸡新城疫、鸡传染性喉气管炎的鸡病料进行检验，结果得出98 份分阳性病料，对98 份均给予测序炎症以确保试验的准确性，经序列检测及对比，病料与鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒同源性达100%。

4 讨论

在现阶段我国鸡养殖行业中，鸡疫情一直都是难以解决的问题，而且疫情逐渐趋于复杂，在很多地区鸡新城疫与鸡传染性喉气管炎发病有高度的相似性，这两种呼吸道疾病对鸡的健康有严重危害，而其高度相似性对进行诊断及治疗有巨大影响，因此，必须要通过专业试验方法进行诊断才能保证治疗有效。而传统的试验检测方法一般都较为费时费力，且对诊断结果不够准确，敏感性较差，因此，本次研究主要通过建立传染性喉气管炎病毒（AILT）和鸡新城疫病毒(ND) 双重检测方法，旨在促进加强我国鸡疫情检测效率。本次研究建立的双重PCR 检验方法，鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒双重PCR 检测方法的灵敏度都为10 拷贝/L，对比常规的PCR 检测方法灵敏度提高100 倍，经过多次重复，检验结果均相同。此外，检验的CT 值和常规检验方法对比，其CT 值无明显差异，均为4%之下。特异性试验结果：在反应体系内单纯添加鸡新城疫病毒或鸡传染性喉气管炎的核酸作为模板，再后续同时添加鸡新城疫病毒或鸡传染性喉气管炎的引物及探针所进行的PCR 定量检验中，所得结果显示，只有对应病毒的特异性曲线，试验结果证明，所涉及的引物和探针都具备较强的特异性。在稳定性试验中，一共进行3 次重复检验，所得结果相同，表明该次建立的PCR 双重检验方法具备良好的重复性及稳定性。样品试验结果：使用本次研究所建立的双重PCR 检测方法对150 份疑似鸡新城疫、鸡传染性喉气管炎的鸡病料进行检验，结果得出98 份阳性病料，对98 份均给予测序炎症以确保试验的准确性，经过序列检测及对比，病料与鸡新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒同源性达100%。从试验结果可以得出，本次建立的鸡传染性喉气管炎病毒和鸡新城疫病毒双重PCR 检测方法具备良好的敏感度、特异性及准确性，是一种高速、快捷的检测方法。