复合诱变选育高产洛伐他汀红曲菌

陈秉梅 孙丽娟 陈巧如

摘 要： 为了提高紫色红曲霉菌M21发酵产洛伐他汀的含量，首先确定了紫外线、亚硝酸和氯化锂单诱变剂的最适诱变剂量，再采用紫 外 亚 硝酸和紫 外 氯 化锂复合诱变剂对出发菌株M21进行诱变选育。结果表明：最适处理剂量为紫外线照射时间90 s，亚硝酸处理时间30 min，氯化锂处理浓度0.8‰。紫外 氯化锂复合诱变剂在最适处理剂量下对原始出发菌株M21的复合诱变效果更佳，得到了3株高产突变菌株ULi17、ULi19和ULi26，洛代他汀产量比出发菌株分别提高75.2%、60.4%和67.0%，遗传稳定结果显示ULi17产量最高、遗传性状较为稳定，因此将ULi17确定为后续研究的出发菌株。

关键词： 洛伐他汀;紫色红曲霉菌;诱变选育

中图分类号： Q939.97文献标志码： A文章编号： 0253-2301（2020）06-0007-05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.06.002

Breeding of High-yield Lovastatin from  Monascus  Strains by Complex Mutagenesis

CHEN Bing-mei， SUN Li-juan， CHEN Qiao-ru

（Fujian Vocational College of Bioengineering， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract：In order to improve the content of lovastatin produced by the fermentation of  Monascus purpureus  M21， the optimal mutagenesis dose of single mutagen such as ultraviolet ray， nitrous acid and lithium chloride was firstly determined， and then the complex mutagens ofultraviolet  ray-nitrous acid and ultraviolet ray-lithium chloride were used to mutagenize the original strain M21. The results showed that the optimal treatment dose was the irradiation time ofultraviolet  ray being 90 s， the treatment time of nitrous acid being 30 min， and the concentration of lithium chloride being0.8‰.  The complex mutagen of ultraviolet ray and lithium chloride had better effect on the complex mutagenesis of the original strain M21 under the optimal treatment dose， and the three high-yield mutant strains ULi17， ULi19 and ULi26 were obtained. The production of lovastatin was 75.2%， 60.4% and 67.0% higher than that of the original strain， respectively. The results of genetic stability showed that ULi17 had the highest yield and stable genetic characters， so ULi17 was identified as the original strain for the subsequent studies.

Key words：Lovastatin;  Monascus purpureus ; Mutation breeding

近年來，高胆固醇血症发生率正以惊人的速度增长，可引发多种心血管疾病并发症，因此严重威胁到公众健康。由于使用降脂药物治疗高胆固醇血症存在较多副作用，人们更青睐于通过服用食品或功能性产品来达到降脂目的[1] 。目前市售的降脂药“脂必妥”和“血脂康”中的主要成分即来源于红曲。研究表明，红曲降脂作用的主要功效成分为其次级代谢产物洛伐他汀，作为胆固醇合成途径中HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂，洛伐他汀可以有效减少或阻断内源性胆固醇的合成[2] 。因此，传统的红曲制造企业纷纷将目光投向具有高附加值的功能性红曲上。常见产洛伐他汀真菌有红曲霉和土曲霉，但产量不适宜大规模生产，因此提高洛伐他汀的产量具有重要意义[3] 。

优良菌株是高产洛伐他汀的基础和关键，因此对菌种进行改良势在必行。菌种改良的传统诱变方法主要有以紫外线、X射线、γ射线、离子束等为主的物理诱变和以碱基类似物、脱氨剂、烷化剂、羟化剂、金属盐类等为主的化学诱变，以及以噬菌体、转座子为诱变媒介的生物诱变[4] 。随着新技术的推广，激光、微波、常温等离子体[5] 诱变技术在微生物育种中得到应用。并且，随着现代生物技术的发展，基因重排技术[6] 、基因工程育种技术[3] 等在高产洛伐他汀红曲菌的定向选育中也展现出独特优势。然而传统的理化诱变具有操作简单、速度快、突变率高等特点，目前仍是获得优良菌株的有效途径，因而不可替代[4] 。但是长期反复使用单一诱变剂诱变之后，菌株易产生“疲劳效应”，引起菌种生长周期延长、活性代谢产物减少等。为了提高诱变效果，在实践过程中常常采用两种或两种以上诱变剂交替或同时处理出发菌株[7] ，因此本研究采用了紫外线、亚硝酸、氯化锂为单一诱变剂确定诱变剂的最适处理剂量之后，采用紫外线加亚硝酸和紫外线加氯化锂复合诱变剂对出发菌株紫色红曲菌M21进行诱变选育，通过遗传稳定性研究，最终挑选出产量高、遗传性状稳定的高产突变菌株ULi17作为后续研究的出发菌株，为功能性红曲的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株 紫色红曲霉菌 Monascus purpureus  M21由本实验室从市售红曲米中筛选得到并保藏。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：去皮马铃薯200g·L-1 ，葡萄糖20g·L-1 ，琼脂条20g·L-1 ，自然pH。

液体种子培养基： 可溶性淀粉40g·L-1 ，麦芽糖40g·L-1 ，蛋白胨20g·L-1 ， MgSO 4·7H 2O 0.7g·L-1 ，K 2HPO 4 0.8g·L-1 ，自然pH。

液体发酵培养基：大米粉 40g·L-1 ，麦芽糖20g·L-1 ，蛋白胨20g·L-1 ，玉米粉15g·L-1 ，NaNO 3 3g·L-1 ，ZnSO 4·7H 2O 1g·L-1 ， MgSO 4·7H 2O  1g·L-1 ， KH 2PO 4 2g·L-1 ，自然pH。

以上培养基均于121℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 孢子悬液的制备 将分离纯化得到的菌株，划线接种于PDA斜面，28℃培养7 d后，加入10 mL无菌生理盐水，用接种环刮下斜面上的孢子，并用漩涡振荡器振荡后，用4层擦镜纸过滤除去菌丝，再用血球计数板于显微镜下计数，将孢子悬液调整成10 6个·mL-1 。

1.2.2 培养方法 液体发酵培养：将斜面菌种制成孢子悬液，取孢子悬液按2%的接种量接种于液体种子培养基中（装液量50 mL/250 mL三角瓶），30℃，150r·min-1 ，培养2～3 d至液体颜色微红，作为种子液。按5%的接种量将种子液接入液体发酵培养基中（装液量50 mL/250 mL三角瓶），30℃，150r·min-1 进行摇瓶发酵培养。

1.2.3 发酵产物中洛伐他汀的检测 发酵液的预处理：取发酵液0.4 mL，加入甲醇1.6 mL，超声振荡20 min，50℃水浴2 h， 5 000 r·min-1 离心10 min，取上清液经0.45 μm有机膜过滤，滤液用来检测洛伐他汀含量。

洛伐他汀含量的检测：采用高效液相色谱法（HPLC）测定。色谱条件为AngilentTC C18 反相色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为甲 醇∶  水（0.15%磷酸）= 80∶ 20;流速1.0mL·min-1 ;检测波长238 nm;进样体积20 μL;柱温25℃。

1.2.4 紫外诱变 取孢子悬液至直径9 cm的无菌平皿中，每皿装液量10 mL，在磁力搅拌下，打开皿盖于15 W紫外灯下30 cm处分别照射30、60、90、120、150、180 s;取经紫外线处理过的菌悬液0.5 mL，依次稀释至 10-3 ～ 10-5 ，立即浸入冰水中暗室保存15 min，以抑制孢子内参与突变体修复的各种酶类的活性，有利于提高突变率。在红灯下取稀释液0.2 mL涂布于PDA平板，每个稀释度作3个平行;按相同方法稀释涂布未经紫外线处理的孢子悬液于PDA平板作对照。平板于30℃培养箱中倒置避光培养3 d，记录平板菌落数，计算致死率。

致死率（%）=（对照平板平均菌落数-诱变处理后平均菌落数）/对照平板平均菌落数×100%

1.2.5 亚硝酸诱变 取孢子悬液2 mL放入密封的无菌小试管中，加入pH 4.5的醋酸缓冲液和0.1mol·L-1 亚硝酸钠溶液各1 mL，于30℃下分别水浴处理0、10、15、20、25、30、35 min后加入Na 2HPO 4溶液（pH 8.6） 20 mL使pH下降到6.8，以终止反应[8] 。稀释涂布平板后放入30℃培养箱培养3 d，记录菌落数，计算致死率。

1.2.6 氯化锂诱变 取0.2 mL孢子悬液均匀涂布于含氯化锂浓度分别为 0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰和1‰的平板培養基中，以不含氯化锂的平板为空白对照，放入30℃培养箱培养3 d后统计菌落数，计算致死率。

1.2.7 紫外 亚硝酸复合诱变 根据紫外和亚硝酸诱变致死率试验结果选择最适紫外线照射时间和亚硝酸处理时间，将制备好的孢子悬液经紫外线照射后取2 mL放入密封的无菌小试管中进行亚硝酸诱变处理至最适时间后稀释涂布平板，30℃避光培养7 d，观察菌落形态变化，挑取生长速度较快或形态变化较大的单菌落，转接到PDA斜面培养7 d后，进行液体发酵复筛。

1.2.8 紫外 氯化锂复合诱变 根据紫外和氯化锂诱变致死率试验结果选择最适紫外线照射时间和氯化锂浓度，将制备好的孢子悬液经紫外线照射后取0.2 mL均匀涂布于含最适浓度的氯化锂平板培养基上，于 30℃培养7 d，观察菌落形态变化，挑取生长速度较快或形态变化较大的单菌落，转接到PDA斜面培养7 d后，进行液体发酵复筛。

1.2.9 突变菌株筛选方法 初筛：从紫外 亚硝酸和紫外 氯化锂复合诱变后的平板培养基上分别挑选30株生长较快或菌落形态与原菌株有明显变化的单菌落。

复筛：将初筛得到的突变菌株转接到PDA斜面上，28℃培养7 d，制备孢子悬液，进行液体发酵培养10 d，用HPLC法测定发酵液中洛伐他汀含量，挑选出产量较高的菌株。每一突变菌株各做3个平行组。

1.2.10 诱变菌株遗传稳定性试验 将复筛得到的高产洛伐他汀突变菌株接种于PDA斜面上，28℃培养7 d后作为第1代，第1代斜面菌落转接至新的PDA斜面上，28℃培养7 d后为第2代，以此类推连续传至第5代，每代液体发酵培养10 d后测定发酵液中洛伐他汀含量，并记录。

2 结果与分析

2.1 诱变剂量的选择

紫外线、亚硝酸和氯化锂单诱变剂对紫色红曲霉菌株的诱变致死情况见 图1～ 3。为了获得较高的正突变率，方便突变菌株的进一步筛选，一般选取致死率为90%[9] 时的处理剂量确定为各诱变剂的最佳诱变剂量。因此各诱变剂最合适的处理剂量为：紫外线照射时间选择90 s，亚硝酸处理时间为30 min，氯化锂处理浓度为0.8‰。

2.2 紫外 亚硝酸复合诱变正突变株的筛选

选取紫外线照射90 s、亚硝酸处理时间30 min进行复合诱变，诱变后平板上的突变菌株菌落大小不一，多数长势缓慢退化，菌苔稀薄，少数生长较快。经初筛获得复合诱变突变菌株30株，编号为 UH1～ UH30，分别对其进行液体发酵培养并测定发酵产物中洛伐他汀的含量，结果见图4。由图4可以看出，紫外 亚硝酸复合诱变有11株突变株的洛伐他汀产量较出发菌株M21有所提高。其中UH6的产量提高最为明显（83.2g·L-1 ），比出发菌株提高了57.6%。

2.3 紫外 氯化锂诱变正突变菌株的筛选

氯化锂是一种碱金属卤化物，单独使用没有明显的诱变效果，需要与其他的诱变剂配合处理后才具有协同作用[10] 。选取紫外照射90 s、氯化锂浓度0.8‰进行复合诱变，将处理后菌株在PDA平板上培养，其生长形态大小不均一，少数菌落生长较快，多数菌落长势缓慢，菌苔稀薄。挑取长势较好或与原始出发菌株形态有较大差异的单菌落30株，编号为 ULi1～ ULi30，摇瓶发酵复筛并测定发酵液中洛伐他汀含量，结果见图5。从图5可以看出，通过紫外 氯化锂复合诱变，有9株正突变株的洛伐他汀产量较出发菌株M21有所提高。其中ULi17、ULi19、ULi26三株突变株的洛伐他汀产量提高较大，分别为92.5、84.7、88.2mg·L-1 ，较出发菌株分别提高了75.2%、60.4%和67.0%，且均较紫外 亚硝酸复合诱变的高产突变株UH6产量高，由此可见紫外 氯化锂复合诱变效果较紫外 亚硝酸复合诱变效果更佳。

2.4 遗传稳定性试验

经诱变处理得到的高产突变株遗传性状可能不稳定，易发生回复突变或突变性状衰退甚至消失，导致产量下降等问题，因而需要验证其传代稳定性，以便选择连续传代后性状稳定的高产突变菌株作为工业化生产的出发菌株。对突变菌株ULi17、ULi19、ULi26分别连续传代5次，结果见表1。由表1可知，ULi19和ULi26传代过程中产量降幅大，高产洛伐他汀的性状不稳定。ULi17降幅小，遗传性状较为稳定，因此选择ULi17作为后续研究的出发菌株。

3 结论

紫外诱变能引起碱基互换、错配、缺失或移码突变，还能使相邻的两个嘧啶共价连接形成嘧啶二聚体，导致DNA双链出现扭曲而变形，使碱基错配引起突变或死亡[11] 。而化学诱变剂能够引起碱基的替换、缺失等DNA的结构改变，从而引起遗传物质的变异。紫外诱变技术设备简单、使用方便、诱变效果好，因此常常与化学诱变剂联合使用，以期提高诱变效果。因此，本研究首先探讨了紫外线、亚硝酸、氯化锂单诱变剂对紫色红曲霉菌株诱变致死情况，确定了最适处理剂量为紫外线照射时间90 s、亚硝酸处理时间30 min、氯化锂处理量0.8‰。然后采用紫外线加亚硝酸和紫外线加氯化锂复合诱变剂在最适处理剂量下对原始出发菌株进行诱变选育，结果表明紫外 氯化锂复合诱变效果更佳，得到了3株高产突变菌株ULi17、ULi19和ULi26，洛伐他汀产量比出发菌株分别提高了75.2%、60.4%和67.0%。这可能是由于这两种诱变剂的特异性作用位点不同，联合应用引起红曲霉菌体内遗传物质的多种变异，导致诱变效果明显提高。其中，ULi17洛伐他汀产量更高、遗传更稳定，因此将ULi17确定为后续研究的出发菌株。拟在后续试验中，通过进一步优化发酵工艺条件，提高洛伐他汀的产量，同时降低有毒物质桔霉素含量，为功能性红曲的进一步开发利用提供依据。

参考文献：

[ 1] 肖连冬，王志强.降胆固醇红曲霉菌株的分离及其降解性能研究[J].中国酿造，2015，34（5）：74-77.

[ 2]王明娟，刘静，康帅，等.红曲药材中洛伐他汀含量及指纹图谱的质量评价[J].中国药事，2018，32（9）：1226-1231.

[ 3]沈小瑞，王钰，陈达伟.红曲霉 LovD 基因的克隆及转基因高产洛伐他汀菌株筛选[J].生物学杂志，2019，36（4）： 23-25.

[ 4]赵川，罗建军，陈少华，等.微生物菌种改良筛选新技术研究进展[J].生物技术通报，2009（S1）：118-121.

[ 5]祁田甜，张婵，胡济美，等.常压室温等离子体诱变技术选育高产Monacolin K紫色红曲霉突变株[J].食品科学，2015，36（9）：66-70.

[ 6]李亮，林娟，叶秀云.利用基因组重排技术选育高产洛伐他汀红曲菌株[J].福州大学学报（自然科学版），2017，45（5）：754-758.

[ 7]馬少丽，刘欣.常用诱变育种技术在我国真菌育种上的应用[J].青海畜牧兽医杂志，2014，44（1）：42-44.

[ 8]施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学[M].北京：科学出版社，2009：59-65.

[ 9]CHEN B M，XU X P，HOU Z G，et al.Mutagenesis of a New Isolated Strain  Bacillus  sp.B26 for Producing （ R ）- α -Hydroxyphenylacetic Acid [J].  Chinese Journal of Chemical Engineering ，2011，19（4）：636-643.

[10]刘颐屏.抗生素菌种选育的理论和技术[M].北京：中国医药科技出版社，1992：45.

[11]诸葛健.工业微生物育种学[M].北京：化学工业出版社，2006：77-78.

（责任编辑：林玲娜）