大型真菌标本制作方法简述

徐关林，陈光富

（丽江师范高等专科学校应用技术学院，云南丽江674199）

在自然界中，大型真菌是生物多样性的重要组成部分，其种类多、分布广，从用途上可简单分为食用菌、药用菌、毒菌3 类。我国对大型真菌的利用历史悠久，《唐本草注》、《菌谱》和《本草纲目》等文献资料中就有对大型真菌利用的早期记载[1-2]。大型真菌标本是菌类研究[3]、生物教学、科普宣传等方面的重要凭证和展示材料，因此能否制成一份优良的标本对教学效果、鉴定结果和研究结论会产生一定影响。大型真菌标本主要包括浸制标本、干制标本、外形和剖面标本及孢子印制取等4 类[4-5]，选取方法需根据真菌类型、标本用途决定，其间的差异主要体现在药品选择、制作工序、处理时间等方面。该文对文献记录进行梳理总结，归纳大型真菌标本制作的常用方法，以期为教学、科研和标本管理提供基础参考。

1 浸制标本制作

大型真菌浸制标本，因可以保持原有形态特征，便于鉴定，因此在教学活动和科普教育中常作为重要展示材料，该方法主要应用于肉质化明显的真菌。标本制作时一般先配制好保存液直接保存或用固定液预处理，具体步骤包括：①将子实体清洗干净后放入透明标本瓶中，然后将事先制备好的保存液倒入；②如果标本会浮起还需栓上玻璃片或玻璃棒，要确保标本浸泡在保存液中；③密封瓶口后避光放置；④标本瓶上贴采集及鉴定标签，然后入库保存。保存液通常用酒精（70%）和福尔马林按50∶3或200∶1 的比例，或用甲醛、酒精（80%）按3∶7 的比例，或甲醛10 mL、硫酸锌25 g、蒸馏水1000 mL 的比例配制而成[4，6-9]。

浸制标本会因长期浸泡而使保存液变浑浊，甚至让标本褪色，因而需频繁更换保存液。程地林等[17]以竹荪为试验材料对保存液进行改良研究，结果显示以甲醛（37%～40%）∶蒸馏水∶无水二氯化钙（10%）=1∶8∶1 比例配制的保存液保存标本8 年，未见标本褪色、保存液浑浊等现象，从而提升保存效果和降低药品的使用量，降低成本。牛宝清通过研究比较NaCl、EDTA、甲醛、酒精、CTAB等试剂对真菌组织块的保存效果，认为无水乙醇（100%）的综合保存效果最优[10]，但由于酒精会引起组织收缩和硬化，而冰醋酸会使组织轻微膨胀，因此，有学者在制作浸制标本时会在保存液中添加一定比例的冰醋酸，用以提升保存效果[11]。

浸制标本相对于干制标本具有明显优势，比如制作过程节省时间、可以保持子实体原有形态等，从而便于教学与鉴定[9]。但也存在一定缺陷，比如需浸泡在标本缸内，这无疑增大了保存空间，且不便于随时携带。如想获得色泽更佳的标本，则需根据菌类颜色深浅而配制试剂，且深颜色菌类还要根据其色素是否溶于水再选择合适的制作方法。

1.1 白色或浅色类大型真菌标本制作

对白色或浅黄等浅颜色的大型真菌，通常用甲醛（5%）、酒精（70%）或两者的混合液进行浸泡，也有学者按硫酸锌25 g、福尔马林10 mL、水1000 mL 的比例或硫酸锌2.5 g、甲醛l0 mL、水1000 mL 和甲醛∶酒精（50%）∶水=1∶6∶40 的比例配制浸泡液[5，12-13]。杨琴等[14]以金针菇、鸡腿菇、平菇、香菇等食用菌为研究对象进行研究，结果显示以上菌类更加适合先固定后保存的处理方式，且需根据子实体的性质适当调整保存液配制比例，浸制效果较好，比如金针菇按甲醛∶酒精（50%）∶冰醋酸=2∶17∶1 的比例，鸡腿菇按甲醛∶酒精（70%）∶冰醋酸=9∶182∶9 的比例；平菇按甲醛∶冰醋酸∶氯化钾水溶液（10%）∶蒸馏水=2∶1∶2∶15 的比例配制。

1.2 深色类大型真菌标本制作

深色大型真菌，在制作浸制标本时常用药品主要包括醋酸汞、冰醋酸、酒精、硫酸铜、无水亚硫酸钠、浓硫酸等[12]。在制作深色大型真菌标本时应该着重考虑子实体所含色素是否溶于水，再选择合适的药品配制保存液。

（1）色素溶于水，易导致子实体褪色，在处理这一类子实体时要选择可防止色素溶于水的药品。保存液通常按1 g 醋酸汞∶1000 mL 乙醇（90%）∶10 g 中性醋酸铅∶10 mL 冰醋酸的比例或用1 g 醋酸汞∶990 mL 乙醇（90%）∶10 g 中性醋酸铅∶10 mL 冰醋酸的比例进行配制[5，13，15]

（2）色素不溶于水，一般先用固定液预处理，其后用保存液保存。固定液参考福尔马林（40%）∶蒸馏水= 1∶7 的比例配制，固定液预处理1 h，用保存液换洗2～3 次后浸泡至保存液中保存[16]。有学者提出将子实体直接浸泡至保存液中，保存液参照冰醋酸10 mL∶醋酸汞10 g∶蒸馏水1000 mL 或冰醋酸5 mL∶升汞10 g∶蒸馏水1000 mL 的比例配制[5，13]。

2 干制标本制作

大型真菌干制标本是指通过加热或冷冻等方式，使子实体脱水而制成的标本。因子实体脱水，标本会发生变形，失去原有形态不好鉴定，这给教学展示、分类鉴定等带来很大弊端，但干制标本在制作方法上相对浸制标本具有更简单和方便携带，所需保存空间小等优势。子实体呈革质、栓质类的大型真菌一般制成干制标本，肉质化类大型真菌根据需要也可制成干制标本。

2.1 烘干制作方法

干制标本可直接采取日晒、风干、火烘烤、红外灯照射、硅胶吸水干燥、恒温干燥箱烘干等方法制作[5，13]，李亚平等提出先将大型真菌晒干后用清水浸泡，将清水沥干后放置在60℃的恒温箱内烘烤48 h 的方法，标本未出现霉烂和虫蛀等情况[18]。使用火烘烤时需注意保持标本与火焰的距离和烘烤时间，或将子实体放在铁皮、瓦片等隔热板上烘烤，以避免直接接触火焰烤焦标本[6]。硅胶吸收子实体内水分后，会由原本的蓝色变成粉红色，晒干后便可重复使用，因此为确保标本充分干燥，需要持续更换硅胶直至硅胶不再变色为止[8-9，12，15]。采用恒温箱烘干，如果是革质或木质化类大型真菌直接设置在105℃下烘干[9]，如果是其他类型菌类，先将子实体纵向剖开，在50～60℃下烘烤6～8 h，然后通风回潮20～30 min[7，19]。干制标本制作完成后要放入标本盒或标本袋内，贴上标签，同时放入樟脑等防腐剂，若是贮存的地方比较湿润，还要放入一些干燥剂。

2.2 冷冻干燥制作方法

冷冻干燥的方法亦可制作干制标本，并且效果较好。罗国涛[20]通过对电热烘箱、标本夹压制、电冰箱冷冻3 种干制法的对比研究，结果显示，通过电冰箱冷冻干制法得到的标本效果最佳，且操作方法简易。主要步骤包括：①将子实体清洗干净后放入冰箱的冷冻层；②将其温度调到最强档，注意标本不能被冻结；③持续冷冻7～10 d 便可获得冷冻干制标本。陈淑荣和栾玲玲[15]在冷冻干燥的基础上进行了改进，对清洗干净的新鲜标本进行冷冻干燥，其后将其浸泡在聚氨基甲酸乙酯的酒精液中，处理后又将其放入干燥箱内进行恒温烘干。该方法使得子实体表面产生了一层保护层，更利于保存。

因干制标本易变形，针对如何确保干制标本完整性和色泽保持等问题，李朋员等[21-22]开展相关研究，采用自制处理液对标本进行预处理后晾干，从而使子实体保持原有形态和颜色。具体步骤包括：①往40℃的水浴锅内加入600 mL 甲醛溶液，待其温度回升到40℃时，取400 g的尿素分多次倒入并不断搅拌，彻底溶解后备用；②用25%（2 h）、50%（2 h）和100%（12 h）等不同浓度梯度处理液对大型真菌进行浸泡；③将100%浓度的处理液注射入菌体内；④用竹签将子实体整形固定后晾干；⑤将用20%聚乙烯吡咯烷酮K-30 和80%酒精配制而成的处理液均匀涂抹至晾干的菌体表面；⑥再将菌体放至恒温箱烤干后，放入透明玻璃标本展示瓶。

3 外形和剖面标本制作

此种方法主要适用于肉质化较为明显的大型真菌。制作步骤包括：①将动物胶原（15%）均匀涂抹在加厚白纸上，自然干燥备用；②先将子实体从下到上纵向剖开；③选择将其中一半子实体的菌柄和菌盖内菌肉去除，另一半继续纵切成薄片，要求切成的薄片能充分展示该菌的特征；④将去除菌肉的子实体、切片粘贴在白纸上，让材料平整并能展示真菌的外形和剖面特征；⑤在标本上覆盖多层纱布进行压制，干燥后连同白纸粘贴在台纸上并填写标签[4-5]。

4 孢子印制取方法

不同大型真菌的孢子形态、颜色、分布密度等方面均有差异，因此采集的菌类常制取孢子印标本进行分类鉴定，这种方法主要应用于伞菌类鉴定。制作步骤包括：①选取不同对比色的硬卡纸，然后平铺在试验桌面上；②将已经切除菌柄的菌盖菌褶向下平铺在硬卡纸上，或用铁丝制作简易的支撑圆环置于菌盖下面；③在菌盖上面罩上培养皿或烧杯使制取空间密封，静置数小时后取下容器和菌盖进行观察，具体的静置时间根据不同真菌适当调整；④为使孢子能够长期保存在硬卡纸上不脱落，需涂上白乳胶、胶水或新鸡蛋清提取液等，同时粘贴采集标签和填写采集信息，过塑后保存[4，5，8，13，15，23]。

5 展望

在选择制作方法时应充分考虑制作环境、菌类性质、数量以及标本用途等因素，经多次试验后再进行选择。如有条件，可同时制备几类标本进行保存，这样可以弥补各自存在的缺点。随着科技水平发展和对大型真菌研究的不断深入，在教学和研究工作中应不断结合最新研究方法，提高物种鉴定的精准性和保存效果，比如利用分子生物学方法开展ITS 序列分析鉴定，提升大型真菌野外实践的教学效果等[24]。同时，标本制作方法也应不断革新，应该积极融入数字化手段，比如引用3D 建模技术等来建立数字化标本，配合实物标本开展教育教学活动及科学研究工作，这将更有利于资源共享。