“静态保种”在中国地方猪种遗传资源保护中的应用进展

张树山,韩雪峻,姜红菊,戴建军,吴彩凤,孙玲伟,张德福∗

(1 上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室,上海201106;2上海祥欣畜禽有限公司∕上海种猪工程技术研究中心,上海201302)

1992 年联合国环境与发展大会上通过了《生物多样性公约》,首次提出了家畜遗传资源保护在全世界范围内保障食品安全和满足需求具有重要的意义,极大地推动了全球范围内家畜遗传资源保护进程。 目前,动物遗传资源保存(即“保种”)主要有“动态保种”和“静态保种”两种方式。 “动态保种”[1]即传统的活体保种,需要专门建立以群体为保种对象的保种场、保种基地,需要维持一定数量个体的保种群并制定合理的选种选配方案,维持成本较高且面临着疾病、疫情和自然灾害等风险。 “静态保种”[2](即生物技术保种,对遗传物质进行冷冻保存),一般指通过对保种群体部分或全部的配子(精子和卵母细胞)、胚胎、体细胞和DNA 等进行冷冻保存( -196 ℃)建立动物“遗传资源库”(或“基因库”),具有占地少、可完全不受外界疾病、疫情影响,但其应用对相关技术,如配子冷冻、输精∕移植、体细胞克隆等要求较高。

我国地方猪遗传资源丰富,但目前部分品种已灭绝或濒临灭绝,传统的活体保种方式抵抗疫情、自然灾害等的能力十分有限,迫切需要“静态保种”手段对我国现有地方猪种遗传资源进行有效的备份,从而提高其遗传资源保护的可靠性。 近年来,尤其随着猪精液冷冻保存、克隆等技术日益成熟,表明“静态保种”已成为可部分替代传统保种的切实可行的手段。

1 我国地方猪种遗传资源保护现状和紧迫性

我国地域辽阔,不同地区文化、民族风俗和饮食喜爱等的多元化及复杂多样的自然环境孕育出了约占世界猪种数1∕3 的猪品种,是大自然和先人留给我们的宝贵遗产。 然而自改革开放以来,我国育种者和生产者受高生长速率、高瘦肉率等指标为主的需求导向影响,重引进、轻本土品种理念占主导地位,地方品种的选育工作进展缓慢[3]。 此外,近20 年来我国快速城市化、工业化对地方猪种活体保种空间的挤压、对本土猪遗传资源重视程度不够及保种措施不当等因素,造成我国大量地方猪种原有的优良性状逐渐退化,部分品种甚至绝种或已濒临绝种。 如河北省的定县猪、江苏横泾猪已证实绝种,福州黑猪、莆田黑猪、广东大花白猪和蓝塘猪等多个地方品种已处于濒临绝种边缘。

依照原农业部2006 年颁布的《畜禽遗传资源保种场保护区和基因库管理办法》中提出的国家级地方猪种资源保护场标准,有50 个以上地方猪保种场符合条件。 共计有42 个地方猪品种被列入国家级畜禽遗传资源保护名录(农业部公告第2061 号)。 传统保种要求具有良好生物隔离的专门场地且需要一定的维持费用,相当部分专门化保种场亏损严重而难以完成保种目标。

众所周知,丰富的地方猪种资源是一个国家的战略资源,是目前和未来猪育种工作的基本素材,地方猪种遗传资源保护开始受到各界人士和政府的关注和重视。 随着人民生活水平的不断提高,我国猪肉消费需求已步入“量稳质升”阶段,消费者开始注重猪肉的品质。 这意味着,培育优质生态猪肉的品种必须要有丰富的地方猪种资源作为支撑。 此外,从2018 年开始非洲猪瘟给我国养猪业带来巨大冲击至今,这一影响也给传统的活体保种敲响了生物安全警钟。 仅凭传统的活体保种方式存在较大的生物安全风险,采用“静态保种”的手段对地方猪种遗传资源进行备份显得尤为重要。

2 家畜“静态保种”研究进展及应用现状

2.1 静态保种涉及相关技术发展现状

“静态保种”涉及技术主要包括配子和胚胎等细胞∕组织的冷冻保存及人工输精、胚胎移植和体细胞克隆等遗传资源的使用技术,这些技术的发展水平直接决定其能否广泛应用。

2.1.1 猪精液冷冻保存技术

该技术一般指对大体积猪精液通过离心浓缩、添加保护成份并经过适当的降温平衡和冷冻,使精子细胞的代谢几乎完全停止,从而达到长期保存( -196 ℃)的目的。 猪精液冷冻保存技术研究最早始于20世纪50 年代,一直到70 年代才有使用冷冻精液产仔报道[4]。 猪冷冻精液剂型主要有颗粒、细管(0.5 mL和5 mL)和扁平袋(5 mL)等,目前以与程序化冷冻仪和精液灌封机等标准化生产设备相配套的0.5 mL细管为主。 猪的颗粒和细管冷冻精液1975 年就开始用于猪育种,但受制于精液冷冻和输精技术水平,直到本世纪初使用冷冻精液的母猪数量还不到1%[5]。 近十几年来,国内外猪精液冷冻技术发展主要聚焦在以下几方面并取得了较大突破:(1)冷冻稀释液研发主要在冷冻保护剂、抗氧化、抗菌等成分筛选、添加试验,已有多个品牌的商业化冷冻稀释粉(液);(2)精准降温的程序化降温仪问世,可实现猪精子冷冻降温速率实现最优化;(3)猪精液冷冻专用的精液分装、细管打印和封口等设备研发。 使猪冷冻精液规模化、标准化的商业生产成为可能;(4)与冷冻精液相配套的母猪发情鉴定和深部位输精技术研究,大幅度提高了猪冷冻精液的实用价值。 迄今为止,国际上已经召开了八次关于猪精液冷冻保存的大型国际会议,对猪精液冷冻保存技术的发展和应用起到了积极的推动作用[6]。 我国猪精液冷冻保存技术研究虽略晚于国外,但巨大的市场需求极大推动了我国猪冷冻精液商业化生产进程开始步入商业化生产和大面积推广阶段[7]。

2.1.2 胚胎∕卵母细胞冷冻保存技术

理论上讲,胚胎含有动物个体所有的遗传信息,卵母细胞仅包括雌性动物遗传物质。 冷冻的胚胎∕卵母细胞保存不再受时空限制,在猪遗传资源的保护均具有重要意义,可以作为传统保种体系的有效补充。胚胎和卵母细胞冷冻方法类似,先后历经慢速冷冻法、快速冷冻法和玻璃化冷冻法,前二者需要昂贵的程序冷冻仪,后来的玻璃化冷冻法采用将胚胎或卵母细胞含高浓度冷冻保护剂的冷冻液里,直接投入液氮快速冷冻,具有操作简单、对仪器要求低和冷冻效果好等优点,已逐渐取代传统方法成为目前家畜胚胎∕卵母细胞冷冻保存的主要手段。 与其他动物相比,猪的胚胎和卵母细胞均含有较高比例的脂肪成分,导致细胞内结构容易在冷冻-解冻过程发生不可逆性损伤,这是猪胚胎和卵母细胞冷冻技术进展缓慢的主要原因[8-9]。 猪胚胎和卵母细胞冷冻技术难度较大,虽然20 世纪90 年代猪冷冻胚胎移植就已成功产下仔猪,但至今仍没有较大突破[10]。 由于冷冻卵母细胞需要额外经历体外受精操作,猪的冷冻卵母细胞的应用难度明显高于冷冻胚胎,直到2014 年和2015 年才有处于GV 期[11]和MII 期[12]冷冻卵母细胞上获得存活后代。 另外,冷冻猪胚胎保存技术应用也受胚胎移植技术水平制约,冷冻猪卵母细胞则受体外受精和胚胎移植两方面因素影响。 目前猪的胚胎移植主要采用常规手术或腹腔镜微创手术,对操作人员和移植条件要求较高,对母猪维持妊娠有一定负面影响。 在科研人员不懈努力下,已有非手术法猪胚胎移植专用的商品化器械问世,大大降低了技术难度[13-14]。

2.1.3 体细胞的冷冻保存与体细胞克隆技术

1997 年,英国科学家利用体细胞核移植成功获得世界首例克隆绵羊[15],随后在牛[16-17]、山羊[18]和猪[19-20]等家畜先后获得成功。 这意味着可以从任意一头家畜采集体细胞,经培养、构建细胞库和冷冻保存,在需要的时候解冻体细胞后采用体细胞核移植的方法克隆出大量与供体遗传信息一致的个体[21]。 该方法可在不影响生产的情况下大批量地采集公、母畜的体细胞,细胞采集、培养和建库等流程可行性高、成本低。 但受制于传统体细胞克隆对仪器和操作技能较高要求,多年来家畜体细胞的冷冻保存一直不被重视。 近几年手工克隆技术(即徒手克隆)[22]的问世,大幅度地降低了猪的克隆成本和技术难度,为体细胞冷冻保存在猪静态保种中的应用奠定了技术基础,具有广泛的应用前景。

2.2 国内外家畜“静态保种”手段在家畜遗传资源保护中应用及现状

目前,在畜牧业高度良种化和集约化的欧美发达国家中,原有众多品种减少到少数经济价值高的品种和杂交品种,畜禽遗传资源相对匮乏。 而在一些发展中国家,由于良种化程度较低和地域相对封闭等因素,使得一些原有本土品种得以幸存。 在过去全球经济一体化进程中,发展中国家常常忽视本土原有畜禽遗传资源保护,一味通过大量引进外来品种提高畜牧业生产的经济效益,已造成原有地方畜禽品种数量急剧减少。

美国政府从20 世纪90 年代至21 世纪初,先后启动了多个畜禽遗传资源保护项目,调查了本土畜禽品种的数量和地理分布信息,详细测定了每个品种的特性(如外形、育种值和对环境适应性等),并通过全美遗传资源信息网络实现了信息共享;收集并冷冻保存了奶(肉)牛、猪、绵羊和山羊等家畜的遗传物质(如精液、胚胎、卵母细胞和DNA 等),并建立了用于检索的电子数据库[23-24]。 美国已建成一个国家级的畜禽“基因库”,收集了列入国家保种规划的畜禽品种(包括一些外来品种)的遗传资源[24]。

尽管同在欧盟体系下,英国、法国和荷兰等国均建立自己了国家级的畜禽“基因库”,对畜禽濒危品种、具有优异性能的非濒危品种和育种群的典型样本等的精液、胚胎等遗传物质进行有效冷冻保存[25-26]。巴西和印度在畜禽“基因库”建设上也取得了不俗的成绩。 如,巴西国家遗传资源与生物技术研究中心下属“基因库”共计保存了牛、山羊、绵羊、马和驴等14 个品种的52 230 剂冷冻精液和220 枚胚胎[27];印度的国家动物遗传资源局下属的“基因库”已收集了多达31 个畜禽品种97 835 剂冷冻精液(来自257 头种公畜)[28]。 前苏联至少冷冻保存了26 个品种192 头公牛的12.3 万份精液和33 个品种252 只公羊的45.6 万份精液[29]。

我国家畜遗传资源的保护工作几乎与欧美发达国家同步,面对需要保存的地方畜禽品种数量较多。从1986 年开始,中国农业科学院北京畜牧研究所在四年里建成包括来自4 个牛品种和3 个绵羊品种的冷冻“精子库”,共计34 091 份;从1996 年到2000 年,全国畜牧总站畜禽遗传资源保存利用中心初步建立志家畜种质基因库(国家家畜基因库前身),基因库由冷冻精液(牛和猪)、冷冻胚胎(牛和猪)及家禽的血样和DNA 等遗传物质,并建立了生物技术保种(即“静态保种”)技术规程和遗传物质安全管理规范,以及牛、猪和羊等家畜的DNA 数据库[30]。

中国政府十分重视利用“静态保种”手段建立畜禽“基因库”工作,先后颁布了《畜禽遗传资源保种场保护区和基因库管理办法》(2006 年7 月)、《中国国家级畜禽遗传资源保护名录》(2014 年2 月)等法规,并相继建立了国家级畜禽基因库(北京)、国家级地方鸡种基因库(江苏和浙江各1 个)和国家级水禽基因库(江苏和福建各1 个)等[31-32]。 以国家级畜禽基因库(北京)为例,截至2017 年10 月,该基因库共收集和保存了冷冻保存了家畜精液、胚胎和体细胞等遗传物质共计39.4 万份以上。 其中,牛、羊、猪和马等家畜冷冻精液35 万份,共涉及86 个品种;来自51 个品种的牛、羊冷冻胚胎1.2 万枚;采集、培养和冷冻保存了牛、羊、猪和马等家畜耳成纤维细胞8 000 份以上,共31 个品种[33]。

我国地方农科院系统和农业大学等单位在猪地方品种遗传资源保存也做出巨大贡献。 2002 年,江西农业大学建成国内最完备的地方猪种资源基因组DNA 库。 该库采集了国内现存的70 个地方猪种(群)、4 000多个猪个体的血样和组织样,提取并保存了1.2 万份DNA 样品;重庆畜牧科学院建立了荣昌猪的冷冻“精子库”[34];上海市农业科学院畜牧所从20 世纪90 年代至今,对上海地区地方猪品种和培育品种遗传资源进行了有效保存,初步建立了上海白猪(农系、上系)、梅山猪和浦东白猪等多个品种的冷冻精子库、体细胞库,及相应的数据库[21,35-36]。

综上,猪精液冷冻保存-深部位输精技术体系已发展成熟,猪冷冻精液已步入商业化生产并在育种得到了广泛应用,冷冻精液是目前针对公猪性价比最高的“静态保种”手段;玻璃化冷冻法的问世大大降低胚胎∕卵母细胞冷冻的技术难度和成本,并提高了二者的冷冻效果,二者的应用价值也随着体外受精和胚胎非手术移植方法的优化而提高;猪体细胞冷冻保存也是一种被广泛看好的“静态保种”手段,基于前期细胞采集、培养和冷冻保存等过程具有较高可行性,可以对整个保种群体实现体细胞冷冻保存,这样就可在必要的时候对某些个体进行按需“复制”。 此外,还应该以前瞻性的眼光来看问题,不能因为某种遗传物质目前的应用价值较低而忽视,其价值极有可能在未来因某项技术的突破而大幅度提升。

3 结论

从2018 年开始影响至今的非洲猪瘟对我国养猪生产和地方猪种质资源保护均造成了巨大冲击,使仍以活体保种为主的地方猪种面临灭绝的风险。 猪种质资源是一个国家的战略资源,是今后开展猪育种工作的基本素材,对我国未来猪育种和养猪业实现可持续发展至关紧要。 通过政府的政策导向和资金支持,加强科研院所、猪育种企业和专门保种场的“产-学-研”合作、形成合力,以现有“静态保种”手段为现存的地方猪种做好遗传资源的备份,具有非常重要的现实意义。