柴胡皂苷d 对肝星状细胞的作用分析

王 祎 庞 旭 张保财 喻长远 王 磊

(北京化工大学 生命科学与技术学院, 北京 100029)

引 言

肝纤维化(hepatic fibrosis)是因慢性肝损伤而导致的渐进性病理过程,可由肝炎、寄生虫、酒精等因素诱发。 研究发现,肝细胞受损后释放多种细胞因子,包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)等,激活肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)后导致胶原蛋白等细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成与沉积,造成肝纤维化。 因此,HSC 是肝纤维化形成的细胞学基础,也是治疗的核心靶点之一[1-2]。

阻止肝纤维化是防治肝硬化和肝癌的重要措施[3],但由于目前尚无有效的临床药物,所以抗肝纤维化药物的研发受到了广泛关注[4-5]。 中药柴胡指伞形科植物柴胡(又名北柴胡,Bupleurum chinense DC.)或狭叶柴胡(又名南柴胡,Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根。 以柴胡为君药的小柴胡汤被广泛用于多种肝病的临床治疗,如病毒性肝炎、肝纤维化和肝癌等[6-8]。 Shimizu[9]证明小柴胡汤可减轻氧化应激和抑制HSC 增殖,从而抑制肝纤维化发生。 柴胡皂苷d(saikosaponin d,SSd)是柴胡的主要活性成份之一[10-11],可通过诱导凋亡和自噬作用抑制癌细胞的增殖[12-14]。 李素婷等[15]报道SSd通过降低α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)含量,抑制HSC 活化和酒精性肝纤维化发生;沈艳婷等[16]认为SSd 通过雌激素受体β(ERβ)抑制转录激活蛋白-1(AP-1)和核因子NFκB 的表达而抑制HSC 活化。 本研究以TGF-β1 诱导活化的大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)为纤维化细胞模型,通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRTPCR)和流式细胞法等技术分析SSd 对该细胞模型的作用效果,从而为中药柴胡的现代化应用提供支持。

1 实验部分

1.1 实验原料和仪器

大鼠肝星状细胞系HSC-T6 购自中国医学科学院肿瘤医院。

SSd(CAS:20874-52-6)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(纯度≥98%);TGF-β1 购自英国Abcam 公司;CCK-8 细胞增殖试剂盒、总蛋白含量检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;FastKing RT 反转录试剂盒(含gDNase)、培养细胞/细菌总RNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;Fast SYBR Green Master Mix 试剂盒购自美国Thermo Fisher 公司;CellTiter-Glo ®发光法细胞活力检测试剂盒购自美国Promega 公司;Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

Rotor-GeneQ qRT-PCR 仪,德国Qiagen 公司;MoFlo XDP 高速流式细胞分选仪,美国Beckman Coulter 公 司; EnSpire 多 功 能 酶 标 仪, 美 国PerkinElmer 公司;DL-CJ-2ND 超净台,北京东联哈尔仪器制造有限公司;Forma 3110 二氧化碳培养箱,美国Thermo Fisher 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SSd 母液制备

称取1 mg SSd 溶解于20 μL 二甲基亚砜(DMSO),加入980 μL 磷酸盐缓冲液(PBS,pH =7.4)混匀后备用。

1.2.2 HSC-T6 培养、活化与增殖率检测

细胞培养:使用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基,于37 ℃、5% CO2贴壁培养,每48 h 更换培养基。 细胞铺满培养皿底80%后使用0.25%胰酶消化传代。 后续实验选择对数生长期细胞。

HSC-T6 细胞以5 000 个/孔接种于96 孔板。TGF-β1 溶于10 mmol/L 柠檬酸(pH =3.0)配制成50 μg/mL 母液。 细胞培养24 h 后去除培养基,用PBS 清洗后换用无血清培养基。 对照组不加药物,实验组加入TGF-β1 或SSd +TGF-β1 培养24 h。更换培养基,每孔加入100 μL CCK-8 试剂,继续培养2 h 后用酶标仪在450 nm 波长下测得各复孔光密度值(OD)。 通过式(1)计算细胞增殖率(PR)。

式中,ODE为实验组OD450均值,ODC为对照组OD450均值。

1.2.3 细胞凋亡分析

细胞培养24 h 后去除培养基,用PBS 清洗后加入无血清培养基和TGF-β1 或SSd +TGF-β1 继续培养24 h。 胰酶消化,800 r/min 离心10 min,收集细胞。 用预冷的PBS 洗涤细胞3 次,Binding Buffer洗涤1 次。 用Binding Buffer 重悬细胞至1 ×106个/mL。 取100 μL 细胞悬液加入5 μL Annexin V-FITC混匀,室温避光孵育10 min。 加入5 μL PI,室温避光孵育5 min 后加入390 μL PBS 混匀。 用流式细胞仪检测,并使用Summit 5.2 软件统计和分析数据。

1.2.4 qRT-PCR 测定基因转录水平

分离纯化细胞总RNA,经体外一步法反转录为cDNA。 使用SYBR Green 为荧光标记,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)或原癌基因abl-1 为内参。每个样品设置3 个重复。 结果用2-ΔΔCT值法分析mRNA 相对含量,并以对照组为1。 qRT-PCR 引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成,序列如表1所示。

表1 qRT-PCR 引物Table 1 qRT-PCR primers

1.2.5 数据统计

使用Graphpad Prism 6 软件进行数据分析与绘图,结果表示为±SE。 组间差异分析使用t 检验:* P ＜0.05,**P ＜0.01,***P ＜0.001;n. s.,P ＞0.05,无显著性差异。 重复数N≥3。

2 结果与讨论

2.1 SSd 抑制活化HSC 增殖

TGF-β1 是常用的促纤维化细胞因子,可以诱导HSC-T6 细胞活化,表现为细胞增殖与纤维化相关基因表达[17]。 为确定本研究中TGF-β1 诱导建模的最优浓度,分别使用终质量浓度为2、5 ng/mL和10 ng/mL 的TGF-β1 处理细胞24 h,使用CCK-8染色法测定增殖率。 图1 结果显示,TGF-β1 浓度与HSC-T6 增殖率呈正相关,且于5 ng/mL 开始显著提高细胞增殖率(图1,11.9%;图2,11.8%)。

将SSd 母液稀释至终浓度为5、10 μg/mL 和20 μg/mL,分别与5 ng/mL TGF-β1 联合处理细胞。经24 h 测定细胞增殖率如图2,发现5 μg/mL SSd显著抑制了HSC-T6 增殖(PR = -40.3%)。 而10 μg/mL和20 μg/mL SSd 浓度组的细胞死亡率分别达到88.4%和92.7%,证明高浓度SSd 对HSC具有细胞毒性。 由于文献报道中SSd 作用于HSC的最优浓度及半数抑制浓度(IC50)均为4 μg/mL 左右[18-20],所以本研究选择5 μg/mL SSd 与5 ng/mL TGF-β1 联合开展后续实验。

2.2 SSd 抑制纤维化相关基因转录

使用TGF-β1 诱导HSC-T6 24 h 后,采用qRTPCR 对胞内TGF-β1、PDGF、α-SMA 和Col-III 4 种纤维化相关基因的mRNA 含量进行测定。 其中有丝分裂原PDGF 能够促进活化HSC 增殖分裂[21];α-SMA 是HSC 活化的主要标志;而Col-Ⅲ是肝纤维化ECM 的主要成份之一。 结果显示,与空白对照相比4 种mRNA 含量均有不同程度的上升,证明细胞活化程度增加(图3)。 并且TGF-β1 诱导HSC-T6 活化可能存在正反馈调节现象,即活化后的细胞会进一步增加TGF-β1 的表达。 与TGF-β1 单独处理相比,SSd+TGF-β1 处理显著降低TGF-β1、PDGF和α-SMA 的mRNA 含量,说明SSd 具有抑制HSCT6 活化的作用。 但是由于SSd 不影响Col-III 的mRNA 含量,所以推测SSd 不抑制ECM 生成。

2.3 SSd 诱导活化HSC 凋亡

使用TGF-β1 或SSd+TGF-β1 处理HSC-T6,24 h 后采用流式细胞技术分析细胞凋亡情况。 结果如图4 所示,SSd 能够显著增加早期凋亡的细胞比率(Q4),而单独TGF-β1 处理则增加细胞坏死比率(Q2)。 两种处理条件下晚期凋亡细胞(Q1)所占比例差别不显著。

为探究SSd 诱导HSC-T6 凋亡的分子机制,使用qRT-PCR 检测胞内bad、bax 和cas-3 3 种促凋亡基因的mRNA 水平。 尽管SSd +TGF-β1 处理组与空白对照组没有统计学差异(图5,P ＞0.05),但是SSd 仍然表现出增强促凋亡基因转录的趋势。 结合流式细胞分析数据,上述结果表明SSd 通过激活cas-3 凋亡信号通路诱导HSC 发生凋亡。

2.4 SSd 降低HSC 胞内腺苷三磷酸(ATP)含量

线粒体功能异常是导致细胞凋亡的重要原因[22],有文献报道SSd 能够影响线粒体正常功能并引发HSC 凋亡[23]。 使用CellTiter-Glo ®发光法细胞活力检测试剂盒测定胞内ATP 相对含量(将ATP含量与蛋白质浓度的比值进行归一化)分析线粒体状态,结果显示,TGF-β1 单独处理不影响ATP 相对含量,但SSd+TGF-β1 共同处理显著降低了ATP浓度(图6)。 因此,SSd 可能会抑制线粒体的能量代谢,这是诱导HSC 凋亡的另一原因。

2.5 讨论

综上所述,5 μg/mL SSd 能够抑制HSC-T6 活化增殖和纤维化相关基因的转录,并且诱导细胞发生凋亡。 SSd 的作用性质同在研的抗肝纤维化药物相一致,如广谱抗纤维化药物吡非尼酮(pirfenidone)可以降低TGF-β1 表达[24];恩利卡生(emricasan)可以抑制caspase 活性和HSC 活化[25]。 在四氯化碳(CCl4)诱导建立的肝纤维化大鼠模型中,多种实验方案均能够抑制HSC 活化增殖或诱导活化HSC 凋亡[26-28],其中聚乙二醇化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(PEGylated TRAIL)治疗能够抑制α-SMA 表达;针灸联合姜黄素能有效抑制PDGF产生。 由此可见,SSd 具有治疗肝纤维化的潜在临床价值。 需要注意的是高浓度SSd 对HSC 具有明显的细胞毒性,因此要对药物安全性进行充分评估。

3 结 论

柴胡皂苷d(SSd)在体外可以抑制HSC 活化和增殖,降低纤维化相关基因的转录水平。 同时SSd能够诱导活化HSC 发生凋亡,其可能的机制包括激活cas-3 介导的凋亡通路和影响线粒体能量代谢两条途径。 因此,基于SSd 对HSC 的作用效果开发抗肝纤维化药物具有较大的潜力。 本研究为中药柴胡的现代化应用提供了支持。