石莼绿藻提取物能够增强仔猪的抗病能力

任淑静

摘  要：分娩前给母猪注射免疫刺激剂，可以改善母猪传递给仔猪的被动免疫力。本研究评估了石莼绿藻中海藻硫酸多糖提取物（MSP提取物）对妊娠末期母猪的免疫刺激作用。试验检测了四种饲料：对照组（不添加MSP提取物）、MSP1组（按2 g/d 添加MSP提取物）、MSP2组（按8 g/d添加MSP提取物）和MSP3组（按16 g/d添加MSP提取物）。试验饲料分两个阶段提供：最后一次萎缩性鼻炎（Atrophic Rhinitis，AR）加强免疫前和分娩前1周。在母猪血液、初乳和乳中检测到抗博德特杆菌免疫球蛋白抗体，在初乳和乳中检测到总IgA。产前和初乳之间的血液样本滴度动力学显示出MSP3组母猪的血清特异性免疫球蛋白水平提高。此外，与对照组母猪相比，按8 g/d补充硫酸多糖提取物能提高母猪乳中的总IgA水平。尽管不同添加水平的MSP提取物对仔猪生产性能的免疫刺激作用并不同步，但本研究支持将天然海藻提取物（MSP）用作生猪生产上的免疫调节溶液。

关键词：免疫刺激剂;海藻多糖;石莼绿藻;免疫调节

猪呼吸道疾病是全球养猪生产者现今最关心的一种猪病，由其引起的保育猪的死亡数接近保育期总死亡数的54%（美国农业部，2008年）。支气管败血性博德特菌（Bordetella bronchiseptica）是引起猪呼吸道疾病的最重要的病原体之一，也是猪发生萎缩性鼻炎（Atrophic Rhinitis，AR）的主要病因，AR是一种在世界各地猪场的保育舍中高度流行的传染性呼吸道疾病。萎缩性鼻炎的治疗通常是给患病仔猪服用抗生素。然而，抗生素耐药性细菌的增加促使人们开发替代性药物来保护仔猪免受一些疾病（如萎缩性鼻炎）的困扰。新生仔猪的免疫系统尚未发育成熟，在生命的最初几个小时，它们只能通过母猪的初乳和常乳获得被动免疫保护。新生仔猪的存活高度依赖于在其一生最初18 h～36 h内摄入的初乳量以及随后摄入的常乳量。因此，重要的是要改善被动免疫力在母猪与仔猪之间的转移速度，这可以通过在分娩前给母猪注射免疫刺激物来实现。

海藻硫酸多糖提取物（Algal Sulfated Polysaccharide Extracts，MSPs）能为养猪生产者创造一个实用的替代性预防策略，刺激猪产生先天免疫应答反应，减少感染，从而减少抗生素的使用量。海藻是生物活性物（如MSP）的重要来源，海藻硫酸多糖提取物是一组复杂的大分子，具有各种各样的重要的生物活性。这些水溶性化合物存在于海藻的細胞壁中，它们的结构和性质因来源的不同（如绿藻纲、褐藻纲和红藻纲，对应的藻类分别为绿藻、褐藻和红藻）而有所不同。近年来，越来越多的研究表明，海藻硫酸多糖提取物（MSPs）具有广泛的有益的生物活性，如抗病毒、抗氧化、抗癌、抗凝血和抗高脂血的活性。此外，多项研究表明，海藻中的MSP提取物通过调节在先天免疫系统中发挥重要作用的细胞因子和巨噬细胞的活性发挥免疫调节作用。这一作用已在小鼠巨噬细胞的体外试验中得到了证实，也在小鼠的体内试验中观察到。最近，Guriec等（2018）证实，无论是体外对异亲细胞和单核细胞，还是体内经口服用，海藻中的硫酸多糖提取物对家禽而言也是如此。值得一提的是，从绿藻中提取的硫酸多糖提取物具有免疫调节功能，无论是作为粗藻提取物，还是作为不同模型中的高纯度组分，如在小鼠巨噬细胞的体外试验、小鼠和鸡的体内试验以及大菱鲆白细胞和腹腔白细胞的体外和体内试验中。绿藻可增加活性氧和一氧化氮的产生，促进促炎细胞因子的分泌，如肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNFα）、白介素（Interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8、IL-12、干扰素（Interferon，IFN），以及参与总IgA浆细胞活化的细胞因子（TGF-β）和趋化因子（CCL20）的表达，趋化因子是一种已知能够调节动物肠道免疫机能多个方面的趋化因子。因此，海藻提取物已经成为天然生物活性物的充足来源，可作为新一代生长促进剂，同时还可增强猪的免疫功能，改善它们的健康。

本研究评价了绿藻硫酸多糖提取物对母源免疫力在母猪与仔猪之间转移的影响。具体而言，本研究分析了在母猪妊娠期的最后一个月向日粮中添加不同剂量的硫酸多糖提取物对仔猪生长性能的影响以及对血液、初乳和常乳中抗支气管博德特菌免疫球蛋白G（Immunoglobulin，IgG）的抗体水平以及母猪初乳和常乳中总IgA含量的影响。

1  材料和方法

石莼绿藻来自法国布列塔尼Plestin les Grèves海滩，硫酸多糖提取液按Berri等（2016）所述的方法进行提取和分析。用Etoxate试剂盒（法国Sigma公司）检测各内毒素的含量，它们的含量低于试剂盒的检测水平（0.05～0.1内毒素单位/mL）。

32头试验猪为“大白猪×长白猪”杂交母猪，由一家采用“分娩-育肥”生产系统的商业性猪场的母猪分娩，并在同一场中饲养。试验母猪在170日龄时转入隔离区，随后每头母猪接种2 mL AR灭活苗（Porcilis AR-T DF;法国MSD动物保健公司）进行首次免疫，再分别于200日龄和330日龄接种同一疫苗，进行两次加强免疫，后一次接种日期约为母猪预产期前30 d（图1）。试验母猪平均分入4个处理（1个对照组和3个试验组——MSP1组、MSP2组和MSP3组），每组8头，每天分两次饲喂同一种基础日粮（上午8：00和下午5：00），试验组的母猪按2 g/d、8 g/d和16 g/d的剂量补充硫酸多糖提取物，对照组母猪不补充。为了利用硫酸多糖提取物在日粮中的分布，将作为赋形剂的碎饼干（40 g）添加到所有处理的日粮中。赋形剂（对照组）或赋形剂+硫酸多糖复合物（试验组）在连续3 d的两个时间段——最后一次接种抗AR疫苗前和分娩前一周——加入料槽中饲料的顶层喂给母猪（图1）。该猪场通常在仔猪出生后的前两天进行交叉寄养。寄养通常在同一处理的母猪之间进行，且不对所寄养的仔猪采样或评估。

妊娠母猪分娩时，记录每头母猪的窝产仔数和产活仔数，并对所有活的仔猪称重。给每窝仔猪中最早出生的4头活仔猪戴上耳标，并个体称重，断奶时（分娩后21 d）再次称重。在多个时间点上，对每头试验母猪和仔猪经腔静脉采集血样（图1）。用真空容器系统将样本收集入9 mL塑料管中，然后在3 000×g（Labofage 200，美国赛默飞世尔科技公司）下离心2 min，随后分离血清并在-80 ℃下保存供进一步处理。每头母猪分娩开始后2 h，从其前3个乳头中手工收集20 mL初乳，并在分娩后第7天和第21天从相同的乳头中手工收集约30 mL常乳。给母猪颈部肌肉注射2 mL （20 IU）催产素（Cyctovem，法国诗华动保公司），以便于收集母乳。初乳和常乳样本在收集结束后立即置于-20 ℃下保存，以供后续分析。

如Adogony等（2007）所述的那样，通过抗博德特菌ELISA试验（德国IBL国际公司）检测母猪和仔猪的血液、初乳和常乳样本中抗博德特菌的IgG。根据制造商（美国Bethyl实验公司）提供的说明书，用猪专用ELISA定量试剂盒测定常乳中的总IgA浓度。这些分析工作由法国Touraine分析试验室进行。

用Kolmogorov-Smirnov检验验证数据的正常性，用t检验比较不同组别母猪的免疫球蛋白浓度，应用Bonferroni法对多重比较进行校正，用F检验比较回归线的斜率，检查各组间免疫球蛋白水平的变化;当回归线平行时，还需比较它们的起点和高度。数据均以“平均值±标准差（SEM）”的方式表示，P<0.05表示同类数据间的差异有统计学意义上的显著性。所有统计分析均使用GraphPad Prism 4.03（美国GraphPad软件）进行。

2  结果及讨论

寻找能够增强家畜免疫功能的新的天然的生物活性物已成为全球各地现代养猪生产者的一个重要目标。绿藻细胞壁中的硫酸多糖提取物具有重要的免疫调节和免疫刺激功能，可以作为一种有应用前景的且可以提高家畜抵抗传染性疾病能力的预防性添加剂。本研究评价了绿藻提取物MSP对母源免疫力在母猪和仔猪间传递的调节作用，并证明在母猪日粮中添加硫酸多糖提取物可提高仔猪体内的母源免疫力。

本研究表明，硫酸多糖提取物不会影响母猪的窝产仔性能，如窝产仔数以及仔猪初生和21日龄时的体重（P=0.05）。这与Heim等（2015）和Leonard等（2011）的研究结果相一致，这可能是由于在母猪日粮中添加硫酸多糖提取物的时间太晚，因而无法显著影响仔猪的早期生产性能。分娩前34 d，所有试验组母猪的血清含有相同水平的IgG（P>0.05;图2A）。分娩前  30 d对AR进行第2次免疫接种，试验组母猪血清中的IgG水平呈上升的趋势，尤其是在分娩前的第23天。此后，三个MSP组母豬血清IgG水平持续下降，直至分娩后第14天 （P<0.05）。这些结果可能受采集血液样本的时间影响，本研究的采样时间可能不是检测硫酸多糖提取物对母猪血清IgG水平影响程度的最佳时机。Kim等（2009）证明应在接种疫苗3周后采集血清样本来检测IgG水平。然而，在本研究中，接种疫苗3周后在时间上非常接近母猪的预产期。尽管各试验组母猪所产仔猪14日龄时的血清IgG水平存在统计学意义上的相似性（表1），但检测结果表明仔猪血清中的IgG水平相对较高，表明在母猪日粮中添加硫酸多糖提取物会产生有益的作用。

上述结果表明，在母猪日粮中添加硫酸多糖提取物会显著提高IgG从母猪血液向初乳的转移率（图2B），特别是在最高添加量时（MSP3组;P<0.05）。尽管这些发现与Leonard等（2010）的研究结果相似，但需要注意的是，Leonard等（2010）使用的是海藻提取物，且添加的时间较长——从妊娠第109天到断奶。IgG从母猪血液到初乳的转移受FcRn受体的控制，且转移率的提高可能归因于该受体的转移速度，或者通过增加该受体在乳腺上皮细胞上的表达。初乳是仔猪被动免疫的主要来源，通过IgG从母猪转移到仔猪。按16 g/d给母猪补充硫酸多糖提取物（MSP3组），可显著提高IgG从血液向初乳的转移率，但并未在哺乳仔猪的血清中反映出来（表1）;按2 g/d （MSP1组）和16 g/d（MSP2组）给母猪补充，母猪初乳中IgG的相对增加与在哺乳仔猪血清中上观察到的结果一致（表1）。值得注意的是，在任何采样日，不同试验组母猪在乳中IgG含量上均无显著差异（数据未显示）。然而，这可能与之前确定的一些做法有关，如硫酸多糖提取物的补充时机和持续补充的时间。

尽管IgG是母猪血清和初乳中重要的免疫球蛋白血清型，但IgA在母猪初乳中占优势。在断奶前，新生仔猪抵抗当地病原体的侵袭主要是通过乳源性免疫力来实现的。几乎100%的初乳IgG和40%的初乳IgA来自母猪的血清，而大多数常乳IgA（>90%）来自乳腺的局部合成。虽然给母猪饲喂硫酸多糖提取物不会影响初乳中IgA的浓度（表1），但MSP2组母猪哺乳期乳汁中的总IgA水平高于对照组母猪的（P<0.03;图3），这与Leonard等（2010）和Zanello等（2013年）的研究结果一致。分娩后第7天和第21天母乳IgA水平的剂量依赖性增加（图3）表明，每天给母猪饲喂硫酸多糖提取物的最佳剂量为8 g，这可能与可以刺激IgA分泌浆细胞通过肠-乳腺连接转移到乳腺的最佳剂量有关。尽管Berri等（2016）通过体外分析证明，硫酸多糖提取物可刺激CC亚族趋化因子配体20（CC Chemokine Ligand 20，CCL20）[又称巨噬细胞炎性蛋白-3α（Macrophage Inflammatory Protein - 3α，MIP3-α]的表达，CCL20是一种能够调节肠道免疫力多个方面的趋化因子，还需要进一步研究，以更好地确定硫酸多糖提取物对免疫的肠-乳腺连接的作用。

3  小结

本研究证明，硫酸多糖提取物会对母猪和仔猪产生积极的免疫调节作用，不过其总体的免疫作用和更好的抗感染能力仍需通过深入的研究来验证。此外，这种免疫调节作用机制的驱动因素尚不清楚，特定途径（如常乳而不是初乳）上的不同免疫球蛋白滴度以及某些情况下的剂量特异性添加就证明了这一点。本次研究的结果有助于养猪生产者开发出可以预防猪呼吸道疾病的替代方案，不过还需要深入的研究来进一步解释其作用方式。

原题名：Immunomodulating effect of a seaweed extract from Ulva armoricana in pig： Specific IgG and total IgA in colostrum， milk， and blood （英文）

原作者：Frederick Bussy、Le Goff Matthieu和Henri Salmon等