一测多评法同时测定荷叶中4 种生物碱含量

陈 强，张 华，沙 玫，刘永静

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

荷叶（Folium Nelumbinis）为睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥叶，被《中华人民共和国药典（一部）》［1］（2015 年版）收录，主要用于暑热烦渴、暑湿泄泻、脾虚泄泻、血热吐衄、便血崩漏等［1］。荷叶化学成分复杂多样，主要含有生物碱、黄酮、鞣质、有机酸等有效成分［2］。 大量研究表明：荷叶具有多种药理作用，例如降脂减肥、降糖、抑菌和抗氧化［3］等。 近年来的研究更进一步表明：荷叶生物碱类化合物是荷叶降脂减肥功效的主要生物活性物质［4］，是一种具有广阔开发前景的植物来源的减肥资源，但是现阶段对于荷叶生物碱的质量控制大多数是以单一荷叶生物碱的含量作为指标，单一生物碱的含量不能完全反映生物碱的特征。 一测多评法是利用中药有效成分内在函数关系和比例关系，只测定一个成分（对照品可得到者）实现多个成分（对照品难以得到或难供应）的同步测定，具有检测成本低、分析效率高等优点。 本实验采用HPLC 法同时测定了荷叶中N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、荷叶碱和莲碱的含量，并以荷叶碱为内标物，利用以上4 种生物碱类成分内在的函数和比例关系，得出N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、莲碱与荷叶碱之间的相对校正因子fR［5-6］，建立同时测定4 种生物碱的一测多评法［7-12］，为荷叶药材多指标定量测定提供一种新的分析模式。

1 仪器与试药

1.1 仪器 U-3000 高效液相色谱仪和UV 检测器（美国 DIONEX 公司）；XS105 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-500E 超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 N-去甲基荷叶碱对照品（纯度≥98%，南京森贝伽生物科技有限公司，批号：16062601）；O-去甲基荷叶碱对照品（纯度≥95%，上海源叶生物科技有限公司，批号：M17M 9556201）；莲碱对照品（纯度≥98.0%，成都普思生物科技有限公司，批号：PS010846）；荷叶碱对照品（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司，批号：W03J8Z27223）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，西陇化工有限公司）；Milipore 超纯水、三乙胺（分析纯，西陇化工有限公司）；冰醋酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。 荷叶药材产自湖南，购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取N-去甲荷叶碱、O-去甲荷叶碱、荷叶碱和莲碱4 种对照品各5.23、4.98、4.92、1.96 mg，分别置 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即为对照品储备液；精密吸取上述对照品储备液N-去甲荷叶碱、O-去甲荷叶碱、荷叶碱和莲碱各 1.0、0.5、1.0、1.0 mL至25 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取荷叶药材粗粉约0.1 g，精密称定，精密加入10 mL 甲醇，超声30 min，滤过，精密吸取续滤液1 mL，再加1 mL 甲醇稀释，混匀，过0.45 μm 有机相膜，即得供试品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水-三乙胺-冰醋酸（49∶49.2∶1.25∶0.48）；检测波长为 270 nm；流速为 1 mL／min；柱温为 30 ℃；进样量为 10 μL。

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，在上述色谱条件下进样分析。 拖尾因子在0.95～1.05，理论塔板数以荷叶碱计大于2 000。 混合对照品溶液、供试品溶液HPLC 图见图1。

图1 混合对照品溶液、供试品溶液HPLC 图

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密吸取空白溶剂10 μL，在上述色谱条件下进样分析。 结果显示空白溶剂在对照品色谱峰相应位置处未见色谱峰，方法专属性良好。

2.3.2 标准曲线的建立 取混合对照品溶液，分别精密进样 1、2、5、10、20 μL，以对照品的质量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，建立荷叶中4 个生物碱成分定量的标准曲线。 实验结果表明各成分在各自范围内呈现良好的线性关系，结果见表1。

表1 4 种生物碱线性回归方程

2.3.3 仪器精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6 次，计算N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、荷叶碱和莲碱的峰面积的RSD，分别为 1.8%、1.3%、0.4%、1.2%（n＝6），结果表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批荷叶药材粉末6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”色谱条件分别进样分析，分别计算4 个化合物的平均含量及其RSD。结果显示：荷叶药材中N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、荷叶碱和莲碱的质量分数平均值分别为 0.15%、0.06%、0.30%、0.04%，RSD 值分别为1.6%、1.0%、0.3%、0.9%（n＝6）。 结果表明方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 分别精密称取已知含量（N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、荷叶碱和莲碱的含量分别为0.14%，0.07%，0.28%，0.04%）的荷叶药材粉末约0.05 g，共6 份，分别精密加入适量N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、荷叶碱和莲碱对照品储备液 150、50、300、100 μL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”色谱条件分别进样分析，测定峰面积，计算N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、荷叶碱和莲碱的含量，求得平均回收率。 见表2。 结果显示：N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、荷叶碱和莲碱的平均回收率分别为101.16%、98.73%、101.06%、95.95%，RSD 值分别为 1.93%、1.75%、1.33%、2.00%。 结果表明该实验的准确度良好。

表2 4 种生物碱回收率

2.4 相对校正因子的确定

2.4.1 待测组分相对校正因子的计算 根据一测多评法的原理，假设某样品中含有多个组分，选取其中1 个组分k 为内标，建立组分k 与其他组分m之间的相对校正因子：fkm＝fk／fm＝（Wk×Am） ／（Wm×Ak），由此可以导出定量计算公式：Wm＝（Wk×Am） ／（fkm×Ak），式中：Ak为内参物峰面积，Wk为内参物浓度，Am为其他组分m 峰面积，Wm为其他组分m浓度。

选择荷叶碱为内标成分，分别计算O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱和莲碱的相对校正因子，结果见表3。由表3 可知，N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱和莲碱的fR值分别为0.99、1.37、3.16。

2.4.2 相对校正因子重现性考察 首先，分别考察了岛津LC2030、戴安U-3000 2 个品牌的高效液相色谱仪对相对校正因子的影响，分别精密吸取各浓度混合对照品溶液10 μL，利用上述两种仪器进行进样分析，计算各个校正因子。 结果表明不同的高效液相色谱仪对相对校正因子影响较小。

其次，在同一高效液相色谱仪（戴安U-3000）上，考察 3 种不同色谱柱（Diamonsil C18、Hypersil ODS、Phenomenex C18）对荷叶中3 个生物碱类成分相对校正因子的影响。 结果表明不同的色谱柱对相对校正因子的影响无显著差异。

表3 3 种生物碱类成分fR

2.5 一测多评法与外标法测定结果比较 取不同产地的荷叶药材，按照实验中供试品溶液制备的方法制备待测溶液，按照实验要求准确吸取各待测溶液10 μL，分别注入高效液相色谱仪，并按实验步骤“2.1”项中所列色谱条件进行测定，分别采用传统外标法与一测多评法计算各产地荷叶中的含量，结果见表4。 外标法实测值与一测多评法计算的质量分数值相对误差＜3%，认为2 种测定方法测得的荷叶生物碱含量无显著性差异，说明一测多评法在荷叶4 种生物碱类成分含量测定研究中是可行的。

表4 一测多评与外标法测定结果比较 %

3 讨 论

荷叶碱是荷叶生物碱的主要特征性成分之一，作为《中华人民共和国药典（一部）》［1］（2015 年版）荷叶质量评价的成分，其对照品也容易获得，因此本实验选用荷叶碱作为内参物。 采用一测多评法和外标法测定的荷叶生物碱含量比较无显著性差异，说明在荷叶生物碱对照品短缺的情况下，基本可以通过测定荷叶中荷叶碱含量来计算其他3 种生物碱类成分的含量。 一测多评法可以应用到荷叶中生物碱含量测定中，建立相对校正因子，不仅节约时间及对照品资源，且测定结果也比较准确。

本研究对于荷叶中4 种生物碱含量的测定方法，与《中华人民共和国药典（一部）》［1］（2015 年版）荷叶生物碱的测定方法相比，符合中药多成分的特点，有利于中药质量控制的整体性和客观性，更符合中药质量控制方法的要求，对荷叶及其相关产品的质量控制具有重要意义。