木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白工艺优化研究

2020-12-14李富贵马海锐王致远陶志东马娜娜丁功涛

广东蚕业 2020年10期

甘雨李富贵马海锐王致远冉权陶志东马娜娜丁功涛

（1.西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州 730124；2.西北民族大学生物医学研究中心甘肃兰州 730030）

马铃薯是我国重要的农产品之一，因其抗逆性强，在我国被广泛栽培，成为世界上仅次小麦、水稻和玉米的第四大粮食作物[1]。马铃薯蛋白是马铃薯淀粉加工的副产物，新鲜的马铃薯块茎中蛋白质含量为1.7%～2.1%，分为高分子蛋白质、糖蛋白、蛋白酶抑制剂三部分[2]。马铃薯蛋白属于完全蛋白质，是一种优质的植物蛋白源，在食品工业中具有广阔的应用前景，其氨基酸组成有19 种，营养价值很高，能预防心血管系统的脂肪沉积，保持动脉血管的弹性，防止过早发生动脉粥样化，还可防止肝、肾中结缔组织的萎缩和胶原病[3-4]。马铃薯蛋白水解物是以马铃薯蛋白为原料，在酸、碱或酶的作用下，将马铃薯蛋白水解为小分子肽以及游离氨基酸，Asokan 等[5]从马铃薯蛋白水解物中分离出2 种多肽，利用鼠心成肌细胞（H9C2）作为肥大心肌体外模型。

酶法水解马铃薯蛋白的研究，最初是利用酶降解部分蛋白质，增加其分子内、分子间交联或连接特殊功能基团，改变蛋白质的功能性质，以获得良好加工特性的研究[6-7]。目前，关于马铃薯蛋白水解工艺的研究，主要集中于单酶或多酶法[8]。高丹丹等[9]以马铃薯渣为原料，用木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白，通过优化最佳工艺，得到水解度为20.19 %的产物。赵晶等[10]利用胰蛋白酶水解马铃薯蛋白，通过优化工艺条件，蛋白质水解度可达39.9%。张泽生[11]等利用三种酶KD1、KD2、KD3水解马铃薯蛋白，比较三种酶的水解度，通过优化工艺，得到KD3的水解度最高，水解度为48.794 %。本实验采用酶解法，以马铃薯蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白探究pH 值、酶解时间、酶解温度和酶添加量对酶解效果的影响，并在此基础上进行正交实验，探究较佳的水解条件。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

市场选购马铃薯蛋白粉（纯度90 %，陕西斯诺特生物技术有限公司），木瓜蛋白酶（200 000 U/g，南宁庞博生物工程有限公司），中性蛋白酶（150 000 U/g，河南仰韶生化工程有限公司），碱性蛋白酶（200 000 U/g，河南仰韶生化工程有限公司），复合蛋白酶（150 000 U/g，安琪酵母股份有限公司），氢氧化钠、盐酸、邻苯二甲酸氢钾、硫酸、甲醛（分析纯，天津市百世化工有限公司）。

1.2 仪器和设备

AR224 CN 型电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；L9 型可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；FOSS 全自动凯氏定氮仪，DenMark；HH-S4A 型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；GL21 M 型高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的筛选

选用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶进行水解酶的筛选。以厂家提供的商品最适pH 值和温度，取5 g 马铃薯蛋白，按照1 g 蛋白添加1 000 U 单位的酶水解3 h[12]，利用甲醛滴定法测定水解后的氨基态氮含量，并计算马铃薯蛋白的水解率，最终确定实验用酶为木瓜蛋白酶。

1.3.2 马铃薯蛋白水解单因素实验

（1）酶添加量对马铃薯蛋白水解度的影响

称取5 g 马铃薯蛋白粉溶于100 mL 去离子水中，调整溶液初始pH 值为6，分别加入0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的木瓜蛋白酶，55 ℃水解3 h 后，利用甲醛滴定法测定酶解液的水解度。

（2）酶解时间对马铃薯蛋白水解度的影响

称取5 g 马铃薯蛋白粉溶于100 mL 去离子水中，在溶液初始pH 值为6，酶浓度0.5%的条件下，于55 ℃分别水解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 后，利用甲醛滴定法测定酶解液的水解度。

（3）酶解温度对马铃薯蛋白水解度的影响

称取5 g 马铃薯蛋白粉溶于100 mL 去离子水中，在溶液初始pH 值为6，酶浓度0.5%，分别于50 ℃、52.5 ℃、55 ℃、57.5 ℃、60 ℃条件下水解3 h 后，利用甲醛滴定法测定酶解液的水解度。

（4）pH 值对马铃薯蛋白水解度的影响

称取5 g 马铃薯蛋白粉溶于100 mL 去离子水中，分别调节溶液初始pH 值为4.5、5、5.5、6、6.5、7，在酶浓度0.5%的条件下，55 ℃水解3 h 后，利用甲醛滴定法测定酶解液的水解度。

1.3.3 木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的正交实验

依据单因素实验的结果，选择酶添加量、酶解时间、酶解温度、pH 值四个因素，以酶解马铃薯蛋白的水解率为指标进行正交实验[13]，采用L9（34）的正交实验表，实验因素水平见表1。记录实验结果，使用SPSS 和Origin2016 软件分析实验数据。

表1 正交实验因素水平表

1.3.4 数据测定方法

马铃薯蛋白含量测定：凯氏定氮法[14]。

式中：

X：样品中蛋白质的含量（g/100 g）。

V1：试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积（mL）。

V2：试剂空白组消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积(mL)。

C：硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）。

0.0140：1.0 mL 硫酸[c（1/2H2SO4）=1.000 mol/L]或盐酸[c（HCl）=1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）。

m：试样的质量（g）。

V3：吸取消化液的体积（mL）。

100：换算系数。

酶解液中氨基态氮的含量测定：甲醛滴定法[15]

式中：

X：样品中氨基酸态氮的含量（g/ 100 mL）。

V1：测定用样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（mL）。

V2：试剂空白组加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（mL）。

C：氢氧化钠标准滴定溶液的浓度（mol/L）。

0.014：与1.00 mL 氢氧化钠标准滴定溶液[c（NaOH）=1.000 mol/L]相当的氮的质量（g）。

V：吸取试样的体积（mL）。

V3：样品稀释液的取用量（mL）。

V4：样品稀释液的定容体积（mL）。

100：单位换算系数。

水解度计算[16]：

水解度（%）=（氨基酸态氮／样品中总氮）×100。

2 结果与分析

2.1 筛酶实验结果

表2 筛选实验用酶水解率对比

由表2可知，利用不同酶水解马铃薯蛋白，计算其水解率，以马铃薯蛋白水解率为筛酶实验指标，研究发现，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶的水解率分别为29.61 %、11.66 %、14.18 %和19.28 %。因此本实验选用木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白。

2.2 酶添加量对马铃薯蛋白水解率的影响

由图1可知，当酶添加量在0.3%～0.8%之间时，水解率随着酶添加量增加而不断增加，当酶添加量达到0.6%时水解速率逐渐降低。其主要原因可能是随着酶解反应的进行，酶解产物过多阻碍了马铃薯蛋白和木瓜蛋白酶之间基团的结合，导致水解率下降。另外，随着反应增加水解产物浓度后会增加反应体系的黏性和产物抑制[17]，从经济效益上考虑，选择0.6%酶添加量。

2.3 酶解时间对马铃薯蛋白水解率的影响

由图2可知，马铃薯蛋白的水解率随着水解时间的延长而不断增加，直到底物被水解完，水解率变为一个定值。当酶解时间超过3 h 后，水解速率呈现降低的趋势。其主要原因可能是随着酶解的进行，酶解产物不断增加，当酶解产物积累到一定量后会对木瓜蛋白酶产生抑制作用[18]。选择3 h 为水解时间。

2.4 酶解温度对马铃薯蛋白水解率的影响

由图3可知，温度在50 ℃～55 ℃之间时，水解率呈增长趋势，在55 ℃时水解率达到最大；温度在55 ℃～60 ℃之间时，水解率呈下降趋势。可能是由于温度过高破坏了酶的非共价键结构，使酶的结构改变而失活，而温度过低导致内能不够，不足以支持酶和蛋白之间基团的集合，从而造成酶活力下降，进而影响马铃薯蛋白水解[19]，因此选择55 ℃为水解温度。

2.5 pH 值对马铃薯蛋白水解率的影响

由图4可知，pH 值从4.5 到6.0 时，水解率随着pH 值的升高而升高，pH 值从6.0 到7.0 时，水解率随着pH 值升高而下降，pH 值为6 的时候水解率最高，达到20.15%。其原因可能是木瓜蛋白酶分子上的结合基团受到极端pH 值的影响而发生解离，导致底物无法与酶结合；或者是催化基团受到极端pH 值的影响发生解离，导致底物无法被催化生成产物[20]，所以呈现出先升后降的趋势，最终选择6.0 为水解pH 值。

2.6 正交实验结果

由表3中的R 值分析可知，对于马铃薯蛋白质的水解率，A、B、C、D因素对木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的影响次序是D＞B＞A＞C。pH 值是主要因素，酶解时间是一般因素，酶添加量和酶解温度是次要因素，较优组合为A3B2C2D1，即酶添加量0.7%、时间3 h、水解温度55 ℃、pH 值6.0。选择该自由组合条件进行验证试验，得出在该条件下马铃薯蛋白的水解率为28.23 %，与正交试验中提取率最高的一组进行比较，可知马铃薯蛋白质的较佳水解条件为 A3B2C2D1，即酶添加量0.7%、时间3 h、水解温度55 ℃、pH 值 6.0。此条件下马铃薯蛋白的水解率为28.23 %。

表3 正交实验与极差分析

2.7 结果分析讨论

由表4可知，本次实验中用木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白酶的水解率不是很高，可能是因为酶的种类不同或者水解马铃薯蛋白的种类不同，导致水解效率有差异，不同的酶其分子的酶活性基团有差异，结合马铃薯蛋白或者解离马铃薯蛋白的能力各不相同，不同的马铃薯蛋白分子用于与酶结合侧链基团不同，直接影响了结合效率及水解效率[21-22]。