新型冠状病毒药物的研究进展

王 彬 高 伟 李 政

(广东药科大学 药学院 广东 广州 510006)

0 引言

新型冠状病毒肺炎的爆发是由新的冠状病毒2019-nCoV(2019 novel Coronavirus)引起的，现已被正式命名为严重急性呼吸综合征相关冠状病毒SARS-CoV-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2)，这一疫情对全球公共健康构成极大威胁.截至2020年5月7日，该病已传播到200多个国家，全球确诊病例超过359万例，确诊死亡人数超过24.7万人[1].如果不能有效控制疫情，其导致的连锁反应可能给全球卫生系统带来重大压力，并对全球经济产生深远影响.

1 冠状病毒简介

冠状病毒分为四类，即α、β、γ和δ.其中，β类冠状病毒包括急性呼吸综合征病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV)、中东呼吸综合征病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV)和COVID-19病毒(SARS-CoV-2).与SARS-CoV及MERS-CoV相似，SARS-CoV-2入侵下呼吸道系统引起病毒性肺炎，但也可能影响胃肠、心脏、肾脏、肝脏等，导致多器官衰竭[2,3].β类冠状病毒基因组编码多种结构蛋白，包括诱导宿主免疫应答的糖基化S蛋白.S蛋白通过与宿主细胞表面膜上的血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)结合，介导了SARS-CoV-2和SARS-CoV对宿主细胞的侵袭[4,5].此外，病毒基因组还编码几种非结构蛋白，包括RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、冠状病毒主蛋白酶(3CLpro，又称Mpro)和木瓜蛋白酶(PLpro)[6,7].病毒基因组进入宿主细胞后，释放单链RNA，并利用宿主细胞将其翻译，再由病毒蛋白酶3CLpro和PLpro将其切割成结构蛋白[6,7].RdRp负责合成全长RNA模板，得到更多的病毒基因组RNA[8].结构蛋白和基因组RNA复制完成后，将在宿主细胞内完成装配，经胞吐作用释放到细胞外，完成病毒复制的生命周期.因此，针对其生命周期的相关靶标，阻断冠状病毒入侵、复制等过程的药物，将有望成为潜在的冠状病毒治疗药物.

2 新冠肺炎潜在治疗药物

2.1 新型冠状病毒抑制剂

2.1.1 阻止病毒入侵小分子药物. 氯喹及其结构类似物，如羟氯喹、阿莫地喹、帕马喹、伯喹或甲氟喹等，一直被用作抗疟疾的主要药物，但在临床应用中发现其可以对抗多种病毒感染.氯喹通过提高病毒和细胞融合所需的pH值，以及干扰SARS-CoV-2细胞受体的糖基化抑制病毒感染[9]；氯喹除具有抗病毒作用外，还具有免疫调节作用，可协同增强其体内抗病毒作用[9].此外，氯喹能改变M蛋白的成熟，干扰病毒的组装和出芽[10].在体外研究中，氯喹能有效抑制SARS-CoV-2对Vero E6细胞的感染(EC50=1.13 μM；CC50>100 μM，SI>88.50)，对SARS-CoV-2的EC90值为6.90 μM[9].因此，氯喹是一种廉价、安全的药物，在临床上治疗新冠肺炎有潜在的应用价值.随后，Yao课题组发现羟基氯喹(EC50=0.72 μM)体外活性比氯喹(EC50=5.47 μM)更优，且毒副作用更低[11].替考拉宁通过特异性抑制组织蛋白酶L的活性，可显著抑制埃博拉病毒、SARS-CoV和MERS-CoV对细胞的侵袭[12].近期研究表明，替考拉宁能有效地阻止S-HIV-luc(2019-nCoV-Spike-pseudoviruses)病毒进入细胞质，其IC50为1.66 μM[12].尽管对野生型病毒体外和体内复制的抑制作用仍有待确定，这些初步结果表明替考拉宁具有潜在抗病毒活性[12].

Arbidol(阿比朵尔)目前在俄罗斯和中国被用作抗病毒药物，据报道其对多种病毒有抑制作用.根据中国国家生物技术发展中心在新闻发布会上的通报，该药已被列入中国国家卫生委员会公布的第六版《治疗与诊断方案》中用于新冠肺炎的潜在治疗方案.Sofosbuvir是一种抗病毒药物，临床用于治疗丙型肝炎.据报道，该药具有体外抗SARS-CoV活性，表明其对SARS-CoV-2可能也具有潜在抑制活性，然而目前尚无临床结果报道[13].Nafamostat是一种抗凝剂，能够有效抑制MERS-CoV.当前研究表明，该药对SARS-CoV-2具有抑制作用(EC50=22.50 μM，CC50>100 μM)[9].氯硝柳胺是FDA批准的驱虫药，其对多种病毒具有较好的抑制活性，如有效抑制SARS-CoV、MERS-CoV、Zika病毒、丙型肝炎病毒和人类腺病毒等的入侵，表明其对SARS-CoV-2也可能具有潜在抑制活性[14].

2.1.2 蛋白酶抑制剂. 在冠状病毒复制过程中，病毒的主要蛋白酶是3-糜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(3CLpro).Mpro的共晶复合物结构现已公开，可用于高通量虚拟筛选和基于结构的药物设计.

Lopinavir和Ritonavir是用于治疗和预防艾滋病的药物，Lin课题组通过预测其与SARS-CoV-2蛋白酶的相互作用，表明lopinavir和ritonavir对新冠肺炎的治疗作用可能源自其对冠状病毒内肽酶C30的抑制作用[15]；目前已有多个临床试验用于评估lopinavir和ritonavir在新冠肺炎中的治疗作用.Zhang课题组[16]以1.75Å的分辨率测定了Mpro的晶体结构，并用该结构指导了一系列α-酮酰胺抑制剂的优化，以改善先导化合物的药代动力学性质.Macchiagodena课题组[17]基于虚拟筛选、对接和分子动力学研究，确定了抑制SARS-CoV-2的先导化合物.Ton课题组[18]开发了新型深度学习平台(DD)，能够在短时间内对数十亿分子的化合物库进行基于靶标结构的虚拟筛选，将DD应用于ZINC15文库中13亿个化合物的虚拟筛选，确定了SARS-CoV-2 Mpro蛋白的1000多个潜在抑制剂.Tahir-ul-Qamar课题组[19]通过同源模建对含有32297种潜在抗病毒天然产物化合物库进行筛选，分析揭示了9种可能作为潜在基于Mpro抗SARS-CoV-2的先导分子，可用于进一步优化和药物开发.

2.1.3 RNA依赖性. RNA 聚合酶(RdRp)抑制剂 Remdesivir(GS-5734)是C-腺苷核苷类似物GS-441524的单磷酰胺前药，该候选药物能抑制SARS-CoV、MERS-CoV和bat-CoV病毒的感染.Remdesivir(EC50=0.77 μM；CC50>100 μM；SI>129.87)在低微摩尔浓度下可阻断SARS-CoV-2对Vero E6细胞的入侵，并显示出高选择性[9].在体内，Remdesivir对SARS-CoV具有预防和治疗作用；在MERS-CoV感染的Ces1c-/-hDPP4小鼠模型中，使用remdesivir治疗能改善小鼠肺功能、降低肺部病毒载量[20].在接种MERS-CoV 12 h后，Remdesivir干预减轻了病情，降低了肺部病毒复制，肺部病变好转[21].Remdesivir也能抑制小鼠肝炎病毒(MHV)，其EC50与SARS-CoV和MERS-CoV相近[22].Gilead正在对remdesivir开展随机对照临床试验，以评价静脉注射remdesivir治疗SARS-CoV-2的疗效(NCT04252664和NCT04257656)[23].此外，中国正在开展favipiravir临床试验，以评价favipiravir治疗SARS-CoV-2的疗效(ChiCTR2000029544，ChiCTR2000029600)[24].Zhang课题[23]组实验结果表明，Ribavirin可以用于治疗SARS-CoV-2，并推荐与干扰素联合使用.然而，没有评估它们治疗新冠肺炎的临床安全性和有效性.

2.1.4 其它抗病毒药物. Mycophenolate(MAP)是一种抗肿瘤药和抗病毒药物.根据英国国家处方，MAP用于预防肾移植中的急性排斥反应，通常与皮质类固醇和环孢素联合使用.体外研究表明，MPA对 MERS-COV和SARS-CoV的木瓜蛋白酶均有靶向作用[25,26]，MPA对病毒有很强的抑制作用，并且IC50值很低[27,28].MPA可以与干扰素β (IFN-β)联合使用，Wong课题组[29]将这种方法应用于MERS-CoV感染的狨猴，结果发现，这些狨猴体内的病毒载量很高，同时还伴有更严重甚至致命的疾病.根据Mo课题组[30]的论述，MPA治疗MERS-CoV还没有进行临床试验.在Al Ghamdi课题组[31]的研究中，8个病人接受MPA治疗，其中7个结合IFN-β.所有8名患者都存活了下来，但是Mo的综述指出，这组患者的急性生理和慢性健康评估分数低于联合多种抗病毒药物的患者.总之，现有的少量文献表明MPA具有潜在的抗SARS-CoV-2活性，然而，这种病毒抑制剂及其衍生物还没有进行体内试验.Nitazoxanide具有广谱抗病毒活性(流感病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒)，这种广谱抗病毒活性作用机制是干扰病毒复制，由于其广谱抗病毒活性，Nitazoxanide被用于流感和其他急性呼吸道感染的治疗[32].在体外实验中，Nitazoxanide表现出很强抗SARS-CoV-2的活性(EC50=2.12 μM)[9].尽管Nitazoxanide体外抗SARS-CoV-2的活性令人鼓舞，显然需要更多的数据来确定其抗SARS-CoV-2的作用.Wang课题组[9]根据其潜在的体外抑制活性，建议评估该药体内抗SARS-CoV-2的活性.

2.2 抗体

2.2.1单克隆抗体. SARS-CoV和MERS-CoV的单克隆抗体(mAbs)特异作用于S蛋白的S1亚单位，特别是受体结合域(RBD)[33].因此，SARS-CoV-2-RBD有望成为研制SARS-CoV-2单克隆抗体的关键靶点.研制抗SARS-CoV-2单克隆抗体的快速方法之一是评价现有的具有交叉中和活性的SARS-CoV抗体.SARS-CoVS-RBD特异性中和单克隆抗体能够交叉中和bat-SL-CoV，如bat-SL-CoV-W1V1和batSL-CoV-SHC014，表明其也可能交叉中和SARS-CoV-2.世卫组织已将一系列单克隆抗体列为治疗新冠肺炎的潜在候选药物，但在体内外中和SARS-CoV-2的能力仍有待证实.

重组人源化单克隆抗体Bevacizumab可以阻止血管内皮生长因子(VEGF)与内皮受体Flt-1和KDR的结合，在美国被批准用于多种癌症，该药在中国进行治疗新冠肺炎的临床试验评估(NCT04275414).Eculizumab是人源化单克隆IgG抗体，与蛋白C5结合并阻止形成膜攻击复合物(MAC).该药正在进行治疗SARS-CoV-2的临床试验评估(NCT04288713).REGN3048是由Regeneron课题组[34]发现的单克隆抗体，可以与MERS-CoV的S蛋白结合.目前正在进行一期临床试验(NCT03301090).

2.2.2 多克隆抗体. 据Mair Jenkins课题组[35]的研究，8项研究数据表明恢复期血浆治疗SARS的有效性.Shen课题组[36]确诊的SARS-CoV-2和ARDS危重患者，接受SARS-CoV-2特异性抗体(IgG)治疗，血浆治疗后12 d内病毒载量下降并呈阴性.4例ARDS在输血后12 d得到缓解，3例在治疗后2周内脱离机械通气.5例患者中，3例出院，2例输血37 d后病情稳定.由于这项研究样本量小，无法得出有效的结论.FDA批准同情用药使用康复患者血浆治疗SARS-CoV-2危重患者.

SAB-301是一种多克隆IgG免疫球蛋白，由染色体牛的高免疫血浆产生[37].在1期的临床试验中，健康受试者单次注射SAB-301 50 mg/kg似乎是安全且耐受性良好，单剂量药代动力学(PK)显示，在浓度-时间曲线(AUC0-24)下，最大浓度和最大面积呈相对线性关系[37].SAB-301纯化免疫球蛋白能否中和SARS-CoV-2尚不清楚.

2.3 生物反应调节剂

生物反应调节剂(Biological response modifiers, BRM)是通过作用于疾病致病过程中的重要的治疗靶点而与宿主免疫系统相互作用和修饰的物质[38].现已被确立为治疗恶性肿瘤、移植排斥反应以及多种免疫相关的治疗药物，还可以用于预防传染病.它们包括能够增强宿主防御机制的免疫刺激剂，以及能够阻止免疫反应负面作用的化合物.

2.3.1 抗菌肽. 抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)也称为宿主防御肽，可在感染过程中作为宿主固有免疫系统的一部分产生.这些肽是由许多组织和细胞类产生的一大类分子，包括植物、无脊椎动物、脊椎动物、真菌和细菌.大多数AMPs由相对较小(<10 kda)，主要由6-50个氨基酸残基组成，这使其具有两亲性、净正电荷、形状各异等结构特性，有利于其作用于微生物表面.因此，AMPs表现出抗包膜病毒以及细菌和真菌的活性.然而，这些肽也表现出广泛的抗非包膜病毒的活性，并且在病毒感染的多个过程中起作用.防御素是AMPs的一类，1986年首次报道其有抗病毒活性.体外实验表明防御素对HIV、甲型流感病毒、人腺病毒、人乳头状瘤病毒、RSV、单纯疱疹病毒和SARS-CoV都有一定的作用.然而，在病毒感染的动物模型的体内相关研究较少.小鼠β-防御素缺陷小鼠模型显示，防御素通过抑制病毒复制以外的机制，保护小鼠免受流感感染[39].现有多个制药公司考虑将Brilacidin(防御素候选药物)用于治疗新冠肺炎，其在多个临床研究中均具有抗菌、抗炎和免疫调节作用.

2.3.2 Interferon-α. 2003年SARS爆发期间，通过动物研究表明重组人IFN-α2b喷雾剂通过抑制病毒复制可用于治疗感染SARS-CoV的恒河猴[40].进一步的临床研究表明，重组人IFN-α2b喷雾剂能有效降低呼吸道合胞病毒、流感病毒、腺病毒和SARS-CoV的感染率[40].在《新型冠状病毒感染性肺炎诊治标准(第四版)》中，中国卫生委员会专家也将IFN-α喷雾剂列为新冠肺炎的治疗选择之一.我国开展临床试验评估了重组人IFN-α滴鼻剂对医务人员感染SARS-CoV-2的预防作用(NCT04320238).

2.3.3 抗炎疗法. (1) 非甾体类和皮质类固醇类抗炎药.非甾体类抗炎药(Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs,NSAIDs)通过抑制环氧合酶(COX-1/COX-2)发挥作用.皮质类固醇参与了许多关键的生理过程，包括免疫反应和炎症，免疫功能受到抑制的癌症患者通常应用低剂量的类固醇治疗.非甾体抗炎药吲哚美辛具有较强抗犬冠状病毒的活性，显著抑制病毒复制，保护宿主细胞免受病毒的损伤.在剂量为1 mg/kg时，对人SARS-CoV也观察到类似药理活性，表明其对SARS-CoV-2可能具有潜在作用[41].在MERS-COV和SARS-CoV爆发期间，皮质类固醇被广泛使用，皮质类固醇也被用于治疗新冠肺炎患者.然而，世界卫生组织建议谨慎使用皮质类固醇.

(2) IL-6受体抑制剂.IL-6在严重或危重新冠肺炎患者的肺部炎症反应中发挥重要作用.初步研究表明，IL-6受体抑制剂Tocilizumab(Actemra)在新冠肺炎治疗中发挥了作用[42].意大利药品管理局(AIFA)3月19日宣布启动一项二期临床研究(TOCIVID-19)，旨在评估tocilizumab治疗新冠肺炎患者的疗效和安全性[43].Sarilumab(Kevzara)是一种单克隆抗体，通过结合和阻断IL-6受体抑制IL-6.美国正开展临床实验评估Sarilumab 治疗新冠肺炎患者的疗效和安全性[44].

(3) IL-1受体抑制剂.现已证实，IL-1的过度表达是SARS-CoV感染的一个标志物在新冠肺炎中，病毒与TLRs结合，促进 pro-IL-1 的形成和炎性小体的活化.这种炎性小体活化对调节固有免疫系统至关重要，为特异性免疫反应奠定了基础.作为炎性小体活化的一部分，IL1-β随之出现，并介导肺部炎症和纤维化，从而引起受感染宿主的呼吸道并发症.大鼠模型显示IL-1受体拮抗剂降低受感染动物趋化因子的表达[45].Kritas课题组[46]首次表明IL-1家族的抗炎细胞因子可能抑制冠状病毒引发的炎症反应.但目前尚缺乏进一步的证据支持.总之，尽管感染冠状病毒患者的IL-1明显升高，但目前尚无证据表明IL-1受体拮抗剂在新冠肺炎治疗中的作用.

2.3.4 其它药物. Tacroliumus(FK506)是一种免疫抑制剂，主要用于异体器官移植，降低器官排斥的风险.其作用机制主要是抑制参与IL-2生成的神经蛋白.IL-2是一种促进T细胞生长和增殖的细胞因子，是人类适应性免疫反应的重要组成部分.研究人员首次将其作为抑制冠状病毒复制的潜在[47]结果表明，在无毒、低微摩尔浓度下，FK506可有效抑制SARS-CoV、HCoV-NL63和HCoV-229E的病毒复制，使病毒滴度降低到无法检测的水平[48].然而迄今为止，这种免疫抑制剂及其衍生物还没有在人体中开展过临床试验.

2.4 中医药

有记载的文献表明，利用中医药预防传染病的传播可以追溯到几千年前古老的中医实践中，SARS和H1N1流感临床研究的成功初步表明中医药经验是值得探讨的方法.其中，最常用的中草药包括黄芪、甘草、防风、白术、金银花和连翘.

以岭药业研发团队借鉴我国历代医家治疗外感热病的用药经验，如《伤寒论》中“麻杏石甘汤”、《瘟疫论》中的“大黄”、《温病条辨》中的“银翘散”，组成了连花清瘟胶囊的基础配方.Li课题组[49]证明莲花清瘟胶囊通过抑制病毒复制和减少宿主细胞释放细胞因子而发挥其体内药效.中国工程院院士王永炎和李连达等多名专家，经过半年的努力，从《伤寒论》《瘟疫论》《温病条辨》等中医典籍的百余古方借鉴经验，筛选出有效治疗方剂“金花清感方”.金花清感颗粒是一种有效治疗甲型H1N1流感中成药，主要由玉叶金花、金银花、竹叶、甘草、连翘、苦桔梗等中草药提取物制成.有文献报道，金花清感颗粒具有抑制SARS-CoV-2活性.在新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)中，中国国家卫生委员会专家将莲花清瘟胶囊和金花清感颗粒列为新冠肺炎的治疗用药.最近，莲花清瘟胶囊和金花清感颗粒已被批准用于治疗新冠肺炎.

血必净注射液是在中医治疗原则指导下，由经典方血府逐瘀汤裁化而来的中药注射制剂.主要由当归、川芎、赤芍、丹参、牙线红花等五种中草药提取物制成，血必净注射液于2004年获得中国食品药品监督管理局(CFDA)批准，目前已被证实具有抗SARS-CoV-2作用[50].最近，血必净注射液也被批准用于治疗新冠肺炎.

3 总结与展望

尽管曾爆发MERS-COV和SARS-CoV的感染，但全世界对新冠肺炎爆发准备明显不足， 新冠肺炎已导致全世界数十万人死亡.为了降低对人类生活和全球医疗系统的巨大影响，有必要齐心协力，共同开发有效的药物和疫苗，以应对新型冠状病毒和其他高致病性病毒爆发.考虑到临床药物开发过程昂贵的研发成本和漫长的时间周期，新冠肺炎的爆发进一步凸显了开发相对广谱抗病毒药物的价值，以及应用人工智能等创新方法促进药物发现的重要性.目前的药物再利用策略已成为控制SARS-CoV-2感染的首选方案之一.本文概述了冠状病毒形态，以及冠状病毒抑制剂、抗体、生物反应调节剂和相关中成药，重点阐述了应对新冠病毒感染和控制细胞因子风暴相关药物的现有进展，以期为未来相关药物研究提供参考.