肺移植缺血-再灌注损伤动物模型研究进展

李玥宁 ， 程霁婷 ， 周思恒 ， 李红鹏 ， 李庆云

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸与危重症医学科 上海交通大学医学院呼吸病研究所，上海 200025；2.上海交通大学医学院临床医学院，上海 200025）

肺移植后缺血-再灌注（ischemia reperfusion，IR）损伤及相关并发症影响肺移植成功率和远期疗效。 建立恰当的肺移植IR 动物模型可为探究减轻移植肺损伤的机制和策略奠定基础。

动物选择

迄今，用于建立肺移植模型的动物有小鼠、大鼠、兔、犬和猪等。1997 至2006 年报道的动物实验中，2/3 选用啮齿动物，其体积较小，饲养成本低和用药剂量少，实验成本较低；且小鼠的生物试剂类型较多，无需另外制备。 不过，由于动物体积较小，因此手术过程中易损伤其他器官，操作困难。家兔手术操作较简单，但术中易猝死。 犬和猪等大型动物手术过程简单，可用于监测呼吸、血流动力学的实验和某些临床应用前的验证性试验，然而成本较高[1-2]。 另有少数研究采用长尾猕猴、羊及牛等[3]。

模型分类及应用

肺移植模型包括原位肺移植模型和IR 损伤替代模型。原位肺移植模型能模拟肺移植的全过程，但操作复杂，目前常采用改良三套管法[4]建立模型；IR 损伤替代模型操作简单，可行性高，但仅能模拟肺移植的部分病理生理过程。 目前替代模型有“肺离体再灌注模型”和“肺门夹闭热缺血模型”，前者是将离体肺连接到类似体外循环的独立灌注系统中，进行人工控制通气和循环支持，优点在于对肺循环和肺通气的精确控制，缺点是需体外循环设备[5]；后者通过显微外科技术夹闭单侧肺门，阻断该侧通气与血流一段时间，模拟肺移植过程中IR 损伤的效果[6]，操作较简单。

一、大鼠原位肺移植模型

1971 年Asimacopoulos 等[7]首次建立了大鼠原位肺移植模型，但操作难度大且成功率低。 1989 年Mizuta 等[8]将套管技术用于肺移植模型中肺动静脉的吻合， 有效缩短手术时间并降低难度，随后又在支气管吻合中使用此技术，为三套管法的雏形。 近年来，部分学者在传统三套管法的基础上进行改进，以提高肺移植模型的成功率和降低手术难度。 戴斌等[9]选择暂不移除受体原左肺并牵出胸腔，以利于暴露肺门部肺动脉、肺静脉及支气管，开阔手术视野，还可减轻对右侧肺和纵隔的压迫。 此外，在供肺吻合过程中，保留原左肺动静脉及支气管的1/2 管壁做牵引，代替传统三套管法中完全离断受体原左肺再吻合，有助于防止血管撕裂、保持吻合方向及避免吻合口扭转。Habertheuer 等[10]采用受体近端套管技术，即在受体肺动脉和肺静脉上放置套管，而非对供体血管套管。 研究者还采用受体的左下叶肺静脉进行静脉吻合，而非肺动脉干， 并使用三轴血管夹稳定器装置使血管夹在胸腔内稳定地夹紧支气管和血管， 从而避免干扰心脏和对侧肺运动，成功率提高。

近期，Chang 等[11]建立大鼠原位左肺移植模型，研究含低浓度的人端粒酶反转录酶中提取的新型肽GV1001 的肺保存液对肺移植后IR 损伤的保护作用， 结果表明低浓度GV1001 具有潜在的保护作用，因此，在适当的浓度范围内，GV1001 有望成为缓解IR 损伤的抗炎药；Liu 等[12]应用三套管法建立大鼠原位肺移植模型，研究自噬在冷IR 损伤中的作用，发现自噬在冷IR 过程中被激活，调节大鼠肺移植模型的自噬水平，可干预冷IR 损伤。 Ohsumi 等[13]研究发现在大鼠原位肺移植模型中， 七氟醚预处理或后处理肺对早期IR损伤具有保护作用；此外，移植肺中缓激肽水平降低对IR 损伤也有保护作用[14]。 Rajab 等[15]在吻合肺动脉、肺静脉及支气管前，先向受体大鼠静脉注射脂肪乳剂（intralipid，ILP），研究发现， 与对照组比较，ILP 能显著提高经历6 h 冷缺血和24 h 再灌注原位移植肺的氧合能力；Das 等[16]应用原位肺移植大鼠模型， 比较吸入纳米颗粒他克莫司和肌肉注射他克莫司的免疫抑制效果，发现两者效果相似，但吸入法可降低肾毒性等不良反应发生的可能。Watanabe 等[17]利用大鼠原位肺移植模型， 证实脂肪组织源性间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，ADMSC）可强化他克莫司降低同种异体移植免疫反应的作用， 且能减少肺移植后所需免疫抑制药物的剂量及相关并发症。

二、IR损伤替代模型

1.肺离体再灌注模型： 此模型实质上是将离体肺连接于体外循环的独立灌注系统中。 王波等[18]选用SD（Sprague-Dawley）大鼠，麻醉后气管插管，接动物呼吸机。切开胸骨，取出心、肺组织，呈半膨胀状态时完全浸入4℃低钾右旋糖酐（low potassium dextran，LPD）液 6 h。 心、肺组织从保存液中取出, 垂直悬挂于恒温容器中灌注。 灌注期间呼吸机通气。而后建立同种异体血循环通路， 首先经充氮气膜肺将流入道血液去氧化, 再经热交换器变温后的 37℃去氧化静脉血用滚压泵以 40 mL/（kg·min） 流速通过 16 号导管经肺动脉灌入双肺， 经肺氧合后因重力经左心房道流入储血器后再回滚压泵，连续循环灌注。 离体肺持续灌注1 h 后成功建立IR 损伤模型。 Liu 等[19]应用此模型观察到缺血前给予异氟醚和七氟醚可抑制灌注液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH） 活性， 并增加肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 浓度，以减轻大鼠离体 IR 损伤。 Wu等[20]用大鼠离体肺持续灌注和停止通气60 min 再通气60 min 建立模型，研究发现烟酸预处理可抑制肺的氧化应激和炎症损伤，且能减轻IR 损伤引起的肺泡-毛细血管屏障功能障碍。 周縯[21]和李梦倩等[22-23]应用此类模型，研究了右美托咪定对肺IR 损伤的保护作用，证实了右美托咪定通过抑制胞外信号调节激酶 （extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2 和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）激活以及抑制受体相互作用蛋白激酶 3 （receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）/混合系列蛋白酶样结构域 （mixed lineage kinase domain-like，MLKL）介导的肺组织细胞程序性坏死来减轻大鼠离体肺IR 损伤。

2.肺门夹闭热缺血模型：急性肺IR 模型有大鼠、小鼠和犬科模型3 种。

（1）大鼠模型：杨世疆等[24]选用无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级 Wistar 大鼠，麻醉后气管切开，接小动物呼吸机。打开胸腔，用显微血管夹或血管钳[25]自左上向右下夹闭左侧肺门（左肺无通气，肺门血管无舒缩提示阻断满意）。 潮气量减少1/3 后，暂时关闭手术切口，保持肺门阻断60 min。 再打开胸腔，取出血管夹，手控呼吸至左肺完全复张，关闭胸腔，继续辅助呼吸120 min 后拔出气管插管。吴智勇等[26]通过物理降温后阻断左肺门30 min，再以红外线灯复温2 h 的方法，成功建立大鼠深低温肺IR 模型。Yabuki 等[27]选用8 周龄大鼠，适应1 周后麻醉，经气管插管机械通气，吸入室内空气，呼吸频率为80 次/min，呼气末正压2 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），维持麻醉。固定于右侧卧位，左侧后外侧开胸，经第5 肋间隙开胸。 左肺韧带、左肺门切除后，经左奇静脉注射50 U 肝素。 肝素给药后5 min，结束吸气，分别用微血管夹钳夹闭左肺动脉、左肺静脉和左支气管。 在左肺通过湿纱布覆盖保证胸腔37～38℃并保持120 min 的缺血，120 min 后取微血管夹，左肺通气再灌注。闫小强等[28]选用健康成年2 月龄SD 大鼠，雌雄不限，体重250～300 g，采用夹闭左肺门45 min 再灌注120 min 的方法制备肺IR 损伤模型。

（2）小鼠模型 ：郑志坤等[29]选用 SPF 级 C57BL/6J 小鼠。腹腔注射麻醉。 静脉留置针于小鼠声门开放时插入气管，连接小动物呼吸机。打开胸腔，充分暴露手术视野。用显微血管夹自左上往右下夹闭左侧肺门，将排气量减少1/3，暂时关闭胸腔，阻断60 min 后再次打开。 取出血管夹，手控呼吸至左肺完全复张，关闭胸腔，置于32℃恒温箱中，待小鼠完全苏醒后拔出气管插管。 也有应用左胸开放后阻断肺门的方法，缺血时间 30 min 或 60 min，再灌注时间 60 min 或 3 h不等[30-34]。 Razi 等[33]应用小鼠肺IR 模型研究发现天然抗氧化剂膳食亚麻籽（flax seed，FS）可减轻肺 IR 损伤，10%FS喂养可使细胞凋亡蛋白酶水平显著降低，凋亡活性下降。 肺匀浆和支气管肺泡灌洗液分析显示炎症浸润明显减少，抗氧化酶表达明显增加，肺损伤标志物减少。

（3）犬科模型：犬科动物是大动物移植模型的首选[35]。 苏雷等[36]应用血管夹夹闭成年犬左主支气管及左肺动脉和静脉，热缺血1 h 后，在放有冰块和冷生理盐水的塑料袋中模拟冷缺血2 h；去除血管夹，使左肺血流恢复再灌注6 h，成功建立犬肺移植IR 损伤模型[36-37]。 应用犬肺移植IR 损伤模型研究发现中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂ONO-5064 Na 有助于减轻犬单肺移植IR 损伤[38]。 Wada 等[39]应用此模型证实犬肺移植模型远端气道上皮内衬液中TNF-α、白介素-6（interleukin，IL-6）和 干 扰 素-γ（interferon，IFN-γ）的 时 间 变化；Ibrahim 等[40]评估了犬肺IR 损伤模型中人重组后腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）双磷酸酶的治疗作用，发现胞外ATP（extracellular ATP，eATP）的积聚与移植肺的 IR相关，减少局部eATP 堆积可能有助于减轻移植肺的IR 损伤。 Luh 等[41]应用犬肺IR 损伤模型研究蛋白酶抑制剂加贝酯甲磺酸盐（gabexate mesilate，FOY）对犬肺IR 模型的影响，证实了FOY 可通过改善犬肺泡膜通透性、中性粒细胞浸润和活化程度，以减轻IR 诱导的急性肺损伤。张皓[42]亦用类似的方法，成功建立犬肺IR 损伤模型，用以研究去氢骆驼蓬碱在犬肺IR 损伤中的作用及机制。

建立理想的肺移植模型是研究IR 损伤机制并确定防治措施，以及改进手术方法的基础。随着显微外科技术的发展，大鼠、小鼠因其实验成本低更受研究人员的青睐。 在模型选择方面，原位肺移植模型能够模拟肺移植的全部过程，光镜下即可观察到移植肺出现典型的IR 损伤病理变化。 但其操作过程复杂， 研究者需要较高的外科手术水平和丰富的经验；肺离体再灌注模型对实验器材要求较高；肺门夹闭热缺血模型虽仅能模拟IR 过程，但其操作简单，单人即可完成[20]。因此，实验时可根据研究目的和条件选择合适的造模方法。