法尼醇在促氟康唑耐药白念珠菌凋亡中的作用机制

周罗成， 王 宁， 朱莹莹， 张姣姣， 王海嵘， 康 健

（上海交通大学医学院附属新华医院急诊医学科，上海 200096）

白念珠菌 （Candida albicans） 是真菌感染（fungal infection）较为常见的病原真菌之一，其治疗常用到氟康唑等三唑类药物[1]。近年来，由于大量使用三唑类药物，白念珠菌对氟康唑耐药性日益显现。 我国研究显示，白念珠菌血症对氟康唑的耐药率约为10%[2]， 上海长海医院的一项研究显示，2012—2014 年分离的1 764 株白念珠菌对氟康唑耐药率为14.6%[3]。 中南大学湘雅医院2014 年检测出白念珠菌约为12%[4]， 而其他一些地区的单中心研究耐药情况更严重， 如杭州第三人民医院为20.7%、河北医科大学第一医院则是54.1%[5-6]。 故白念珠菌对氟康唑耐药的产生机制研究已经成为热点。

造成白念珠菌对氟康唑耐药的重要机制之一为白念珠菌体内可产生外排泵蛋白，可以将真菌体内的氟康唑泵出， 造成菌株体内有效药物浓度下降，从而导致对氟康唑耐药[7]。与耐药相关的外排泵蛋白主要有多药耐药 1 （multidrug resistance 1，MDR1） 基因转录的渗透性糖蛋白（permeability glycoprotein，Pgp） 及白念珠菌耐药基因 1（Candida drug resistance 1，CDR1）、CDR2 转录的 Cdr1 蛋白（CDR protein 1，Cdr1）、Cdr2[8-9]。 有研究表明法尼醇是白念珠菌的群体感应分子[10]，可竞争性抑制药物外排蛋白的功能，并诱导白念珠菌细胞凋亡。 另有学者构建了Cdr1 蛋白高表达的白念株菌株， 发现法尼醇在白念珠菌细胞内与谷胱甘肽结合成为法尼醇-谷胱甘肽结合物，后者被高表达的Cdr1 蛋白泵排出细胞外，导致细胞内谷胱甘肽耗尽，细胞氧化应激水平增高，最终导致真菌死亡[11]。 同时张晓云等[12]的研究表明MDR1 在氟康唑耐药白念珠菌中也存在高表达。 据此推测，法尼醇可能会通过高表达MDR1 基因转录的Pgp，导致耐药白念珠菌细胞内还原型谷胱甘肽含量减少， 细胞内活性氧类（reactive oxygen species，ROS）积聚增多，胱天蛋白酶3（caspase 3）活性增加，由此导致耐药白念珠菌细胞凋亡。

材料与方法

一、材料

白念珠菌标准质控株SC5314 由中国人民解放军海军军医大学提供。氟康唑购自上海信谊药厂有限公司，胱天蛋白酶3 活性试剂盒及总谷胱甘肽试剂盒购自南京建成有限公司（货号：G007）；酶标仪购自 THERMO 公司（货号：MK3）；还原型谷胱甘肽试剂盒(Glutathione Assay Kit)购自 Sigma 公司（货号：CS0260）；PCR 引物由生工生物工程 （上海）有限公司合成。

二、浓度梯度法诱导氟康唑耐药株

通过浓度梯度法获得本研究所需的氟康唑诱导耐药株。 将白念珠菌标准株在沙氏葡萄糖琼脂（Sabouraud dextrose agar，SDA）培养基培养 48 h，后取单个菌落再次接种在SDA 培养基48 h 以保证菌株的活力及纯度。后取单个白念珠菌标准菌落转种于未含有氟康唑药物的SDA 培养基30℃培养，从而制备成含菌培养液，使得菌液浓度为0.5 麦氏单位。 离心后取菌悬液100 μL 分别涂布于含有不同倍数最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的氟康唑培养液中30℃培养，并分别测定实验菌株对氟康唑的敏感性，最后达到氟康唑敏感株 MIC≤8 μg/mL，耐药株 MIC≥64 μg/mL，符合美国临床与实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推荐的 M27-A3 方 案判定标准，并-80℃保种[9]。

三、四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）比色法

氟康唑耐药组及对照组的白念珠菌均处于对数生长状态， 使用麦氏比浊法确定真菌浓度为1×106～1×107菌落形成单位（colony forming unit，CFU）/mL。2 组中加入法尼醇， 并补充RPMI 1640 培养液使2 组菌液的法尼醇浓度统一为200 μmol/L，37℃孵育24 h。 用酶标仪于570 nm 处以空白孔调零测各孔光密度值。

四、胱天蛋白酶3活性检测

使用胱天蛋白酶3 活性测试盒测定细胞内胱天蛋白酶3 活性。 对样品离心， 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤，去上清，加裂解液冰浴裂解；后 4℃离心（12 000 转/min，10～15 min）； 取样加入 2×反应液、裂解液及 5 μL Ac-DEVD-PNA，37 ℃孵育 4 h， 发现颜色变化比较明显，用酶标仪在λ=405 nm 测定其吸光值A，计算诱导剂与阴性对照A 的比值以确定胱天蛋白酶3 的活性 （氟康唑耐药组胱天蛋白酶活化程度值/对照组相应值）。

五、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量测定

使用微量酶标法测定细胞内谷胱甘肽以及氧化型谷胱甘肽含量。 细胞样品用PBS 洗涤1 次，1 500 转/min 离心，去上清液。按沉淀体积的3 倍体积加5%磺基水杨酸 （sulfosalicylic acid dihydrate，SSA）溶液，震荡悬浮，冻融 2 次，12 000 转/min 离心10 min，取上清液。

在样品上清液中加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotine adenine dinucleotide phosphate，NADPH），前、后 5 min 各于 412 nm 处读值，计算ΔA412。 使用谷胱甘肽标准溶液的值来确定标准曲线，并计算标准ΔA412/min，根据公式：每毫升样本中的谷胱甘肽（nmol）=ΔA412/min（样品）×样本测试前稀释倍数/ΔA412/min（标准）×样品的体积ΔA412/min （1 nmol） 表示 1 nmol 谷胱甘肽标准曲线的斜率，从而计算出样品中的谷胱甘肽含量。

使用总谷胱甘肽测定试剂盒（微板法）测定其含量。在样品中加入测定盒试剂，并充分混匀，酶标仪中 405 nm 处前、后 5 min 读取 2 次数值 A1、A2并计算，ΔA=A2-A1，根据公式：总谷胱甘肽=ΔA（测定值）/ΔA（标准值）×标准品浓度×样品测试前稀释倍数。

氧化型谷胱甘肽=总谷胱甘肽含量-谷胱甘肽含量。

六、细胞内ROS检测

用酶联免疫吸附测定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 试验测定各组白念珠菌胞内ROS 活性，对结果取相对值（耐药组/对照组）并进行统计分析。 取ROS 活性检测试剂二氯氢化荧光素二乙酸酯（dichlorofuorescin diacetate，DCFHDA）加入培养基，浓度为 10 μmol/L。 37℃孵育待检测细胞60 min，并将收集好的细胞用PBS 重悬。 将DCFH-DA、待检测细胞混合，酶标仪测定，激发波长500 nm，发射波长525 nm。

七、统计学处理

用SAS 软件进行统计分析。 所有实验均重复3 次，取均值。 计量资料以表示，采用 t 检验。 P＜0.05 表明差异具有统计学意义。

结 果

一、2组加入法尼醇后菌株增殖情况比较

MTT 法检测显示2 组菌株的增殖情况， 与0 h对比， 培养24 h 后对照组的细胞增殖率为0.86±0.05，而耐药组为0.64±0.05。 法尼醇对耐药组菌株的增殖抑制较对照组显著（t=5.41，P=0.005 7）。

二、白念珠菌活化胱天蛋白酶-3的检测

白念珠菌细胞内胱天蛋白酶-3 活化程度相对值对照组为1.00±0.00，氟康唑耐药组为1.84±0.70，氟康唑耐药组胞内胱天蛋白酶-3 活化程度明显高于对照组（t=5.16，P=0.035 5）。

三、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量测定

白念珠菌胞内还原型谷胱甘肽的相对含量对照组为 1.00±0.00，氟康唑耐药组为 0.63±0.17，2 组间差异有统计学意义（t=9.27，P=0.011 4）。 白念珠菌胞内氧化型谷胱甘肽相对含量对照组为1.00±0.00，而氟康唑耐药组为 0.32±0.10，2 组间差异有统计学意义（t=28.13，P=0.001 3）。

四、ROS活性的测定

对照组中白念珠菌胞内ROS 活性相对值为1.00±0.00，氟康唑耐药组为 1.45±0.30，差异有统计学意义（t=6.48，P=0.023 0）。

讨 论

有文献报道法尼醇可造成白念珠菌细胞凋亡，其机制之一为法尼醇可以在白念珠菌细胞内与谷胱甘肽相结合，两者形成的结合态被白念珠菌耐药蛋白Cdr1 泵出菌株细胞外， 从而导致细胞内谷胱甘肽减少， 细胞的抗氧化还原能力减弱，细胞死亡[12-13]。但其所用菌株为SC5314 标准菌株及CDR1 基因敲除或 CDR1 基因高表达的 CAI4、DSY449 菌株，且此类菌株均对氟康唑敏感，故不能由此推测法尼醇对氟康唑耐药的白念珠菌具有同样的杀灭作用。

通过浓度梯度法，本研究成功获得了氟康唑耐药的白念珠菌菌株，并在加入法尼醇24 h 后，进行菌株增殖情况的比较，显示耐药菌的增殖被显著抑制，表明法尼醇对氟康唑耐药白念珠菌的增殖具有抑制作用。

胱天蛋白酶家族在介导细胞凋亡的过程中起非常重要的作用，其中胱天蛋白酶3 为关键的执行分子。激活后的胱天蛋白酶3 通过裂解切割多种胞浆、胞核底物，最终导致细胞凋亡的发生[14]。 本研究选择测定2 组菌株胞内的胱天蛋白酶3 活性水平来观察细胞凋亡情况，结果发现，在加入法尼醇后，氟康唑耐药组的胱天蛋白酶3 活性水平为对照组的（1.84±0.70）倍，提示法尼醇能够促进耐药白念珠菌细胞凋亡。

根据之前文献推测法尼醇诱导氧化还原反应的作用机制很可能是：法尼醇和还原型谷胱甘肽形成结合物后，由耐药真菌细胞内高表达的Pgp 将该复合物排出， 导致细胞内还原型谷胱甘肽浓度降低，ROS 活性增强，过高的ROS 水平会使得耐药真菌通过细胞凋亡途径死亡[15]。 本研究发现耐药组中的还原型谷胱甘肽含量下降，ROS 活性水平上升。上述结果提示法尼醇可使耐药真菌体内谷胱甘肽减少，导致其体内氧化应激水平增加，抗氧化能力下降，耐药真菌细胞内ROS 增高，之后通过激活胱天蛋白酶族，促进白念珠菌细胞凋亡，导致耐药白念珠菌增殖显著受抑。

本研究初步发现法尼醇对于氟康唑耐药的白念珠菌有促进细胞凋亡、抑制耐药真菌增殖的作用，其可能的机制为法尼醇导致耐药白念珠菌细胞内还原型谷胱甘肽含量下降，ROS 水平上升， 胱天蛋白酶3 酶活性增加，最终导致耐药白念珠菌细胞凋亡。 鉴于白念珠菌耐药的复杂性，本研究结果或将为耐药白念珠菌的研究方向提供新的选择。