基于文献计量学和系统药理学分析血府逐瘀汤治疗冠心病的分子机制

徐文华赵 阳#宁桂兰马晓聪赵新望王海娟张晓文郑景辉

（1.广西中医药大学，广西南宁 530011；2.广西中医药大学附属瑞康医院心内科，广西南宁 530000）

冠心病是指发生在冠状动脉中的动脉粥样硬化斑块,是世界范围内最常见的心血管疾病［1］。根据《中国心血管病报告2017》,2015年中国城市和农村居民冠心病死亡率继续2012年以来的上升趋势［2］。现代医学治疗冠心病虽然效果明显,但是不良反应明显。中医药治疗冠心病效果良好且不良反应较小。目前,中医药的化学成分和药理活性研究方法很多,包括薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱-质谱法（HPLC/MS）、核磁共振法（NMR）和动物实验、细胞实验、生化实验等［3］。方法耗时、成本高、效益低,仅用传统的实验方法分析中医药的作用机制是比较困难的,因此课题组采用系统药理学方法基于分子层面对血府逐瘀汤进行研究。通过计量文献学方法,对当前治疗冠心病的热门中药或方剂的使用性进行筛选。初步验证和预测了热门方剂治疗冠心病的作用机制,以期为进一步深入揭示其作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 文献来源与检索策略 在中国知网数据库检索自建库以来所收集的中医药治疗冠心病的相关文献,具体检索式见图1。

1.2 提取文献数据并绘制中药相关的高频关键词共现图、聚类分析图 应用书目共现分析系统软件提取检索文献的发表的关键词,选取出现频次≥10以上的关键词作为高频关键词,并对高频关键词进行共现分析。摘取与中药（复方、单味药、中成药）相关的共现关系,导入Cytoscape

3.6.1 软件中生成共现图。摘取中药（复方、单味药、中成药）之间相关的共现关系,导入IBM SPSS v21统计分析软件中生成聚类分析图。

1.3 高频方剂的化学成分收集以及靶点预测 利用TCMSP （中药系统药理学数据库分析平台）数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/）检索高频方剂中的药物对应的化学成分,以建议药物筛选标准：口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%［4］,类药性（drug likeness,DL）≥0.18［5］,筛选高频方剂中高频方剂中的活性成分以及靶点。

1.4 冠心病相关数据构建 本研究基于CTD （应用毒性与基因比较数据库）、TTD （治疗靶点数据库）及GeneCards数据库综合筛选冠心病相关靶点,TTD数据库是一个提供关于耐药性突变的对目标和药物基因表达和目标组合的数据库［6］,GeneCards数据库是一个可搜索的、集成的数据库,它提供了关于所有注释和预测的人类基因的全面的信息。提供GiftS算法,构建基因与疾病的相关度排序,根据“Relevance score” 可在特定疾病对应的众多靶点中进一步筛选相关度更高的靶点从而减少冗余,经三大数据库挖掘共同筛选冠心病相关基因。利用Venn分析工具,将三大数据库与血府逐瘀汤潜在靶点进行比对分析得到血府逐瘀汤作用于冠心病的靶点。并利用Cytoscape 3.6.1软件蛋白互作网络图和化合物靶点图。

1.5 血府逐瘀汤作用靶点的生物信息学分析 将血府逐瘀汤潜在药效靶点的上传到David 6.8数据库 （https：//david.ncifcrf.gov/）中,进行GO （基因本体）分析和KEGG （基因组百科全书）分析。将GO分析生物过程（biological process,BP）、细胞成分 （cellular component,CC）、分子功能（molecular function,MF）结果数据导入GraphPad Prism 7.0软件进行可视化分析。并利用Omicshare （http：//www.omicshare.com/）网站绘制气泡图。

1.6 血府逐瘀汤主要活性成分-血府9010瘀汤对冠心病作用靶点分子对接结果分析系统分子对接（systems dock）Systems Dock Web Site （http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）数据库,是一个基于网络药理学的预测和分析的Web服务器,它应用高精度对接模拟和分子路径图来综合表征配体选择性,并说明配体如何作用于复杂的分子网络。系统对接应用AutoDock Vina进行对接模拟,预测蛋白质和配体结合的性能,调整X-Y-Z坐标和网格大小以细化绑定的位置［7］。对接结果的分数=（PKD/PKI）的负对数,Docking Scores的值通常为0至10。登陆Systems Dock Web Site数据库,将血府逐瘀汤拓扑学参数计算出最主要的5个化合物与血府逐瘀汤治疗冠心病靶点拓扑学参数中计算的前5蛋白输入PDB ID,找活性位点,计算格点,调整X-Y-Z坐标来细化位置。输入化合物的化学分子结构,成功后开始对接,整理对接结果中的Docking Score并分析。

2 结果

2.1 文献检索的结果 根据图1检索式,在中国知网中共收集到自建库以来中医药治疗冠心病的相关文献5 451篇。

2.2 文献的关键词提取结果 通过书目共现分析系统软件（BICOMB）,从5 451篇文献中共提取6 443个关键词,选取频次≥10以上的关键词作为高频关键词,共得到高频关键词309个,频次累计百分比占总频次的60.026 4%。其中27个关键词与中药（复方、单味药、中成药）相关,见表1。摘取与中药（复方、单味药、中成药）相关的共现关系,将所得结果导入Cytoscape3.6.1软件,生成共现图（图2）。导入IBM SPSS v21统计分析软件,生成聚类图（图3）。经文献计量学结果计算发现血府逐瘀汤在中医药治疗冠心病的过程中应用最为广泛。

2.3 血府逐瘀汤有效成分筛选 通过筛选得到血府逐瘀汤活性成分148种,其中枳壳5种、桃仁23种、当归2种、红花22种、赤芍29种、甘草42种、生地黄2种、川芎7种、桔梗7种、柴胡17种、牛膝20种。其中潜在作用靶点138个,作用于冠心病的靶点38个,其中包括细胞色素P450 （CYP3A4）、超氧化物歧化酶（SOD）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、一氧化氮合酶（NOS2）、丝裂原活化蛋白激酶1 （MAPK1）、白细胞介素-6受体亚单位α （IL-6）等。GO分析得到27个生物学过程,其中包括细胞对血管内皮生长因子刺激的反应 （cellular response to vascular endothelial growth factor stimulus）、血管生成 （mammary gland alveolus development）、过氧化氢对缺氧的反应基因表达的正调控（esponse to hydrogen peroxide response to hypoxia positive regulation of gene expression）等；3个细胞组成包括细胞外区域（extracellular region）、细胞小凹（caveola）、细胞外空间（extracellular space）和4个分子功能血红素结合（heme binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、相同的蛋白结合（identical protein binding）、酶结合（enzyme binding）；KEGG分析得到22条信号（取本杰明矫正P＜0.01）通路包括：HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路 （TNF signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路 （PI3K-Akt signaling pathway）、FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）等与心血管疾病高度相关的信号通路 （具体结果见图4～6、表2）。

表1 中药（复方、单味药、中成药）相关的高频关键词

图2 中药（复方、单味药、中成药）相关的共现关系共现图

图3 中药类（复方、单味药、中成药）高频关键词聚类图

图4 血府逐瘀汤的蛋白互作网络图（节点大小、连线粗细根据拓扑学相关参数绘制）

2.4 分子对接结果 系统分子对接结果血府逐瘀汤对冠心病作用靶点分子对接结果如表3所示。一般认为分子对接结合力值大于4.25表示对接分子与靶点之间有一定的结合活性,大于5.0表明对接分子与靶点之间有较好的结合活性,大于7.0则说明具有强烈的结合活性［8］。分子对接结果显血府逐瘀汤多个靶点的Docking Score值大于8.0证明有强烈的结合活性,见图7,且多个靶点大于5.0。由此表明血府逐瘀汤主要化学成分与血府逐瘀汤对冠心病作用靶点有较好的结合活性。

图5 血府逐瘀汤的化合物靶点图

图6 血府逐瘀汤作用靶点的GO分析

表2 血府逐淤汤作用于冠心病的KEGG分析结果

3 讨论

冠心病属于中医“胸痹” “心痛” “心悸” “喘证”“水肿” 等病范畴,中药相对于西药较为安全可靠［9］。中医理论从整体和宏观的角度出发,强调辨证论治、从整体出发协同配伍。但是由于中药配伍的复杂性且具有多因、多效、多靶点的特点,其作用于疾病的具体分子机制难以被阐明。本研究通过文献检索、共现分析和聚类分析等文献计量学分析,探讨中医药干预治疗冠心病的常用药。利用系统药理学的方法根据机体对外援化学物质的吸收、分布、代谢、排泄、以及化合物对机体的毒性筛选出中药有效成分。血府逐瘀汤是经文献计量学计算临床应用研究最为广泛的方剂。现代药理学研究表明［10-11］,血府逐瘀汤可以通过调节mRNA的表达影响细胞的寿命,控制血管的生成,降低神经损伤。并且可以改善脑血管舒缩功能、降低细胞损伤,从而改善血液供应。

图7 血府逐瘀汤主要化学成分与血府逐瘀汤对冠心病作用靶点分子对接结果示例（仅列出Docking值大于8.0的）

表3 血府逐瘀汤主要化学成分与血府逐瘀汤对冠心病作用靶点分子对接结果

对血府逐瘀汤与其他309个高频关键词的共现分析,如图2所示,发现共有29个高频关键词与血府逐瘀汤存在共现关系,其中涉及病机的关键词有血液流变学、血瘀、气虚血瘀、血脂,涉及治法的关键词是活血化瘀,研究表明,血府逐瘀汤治疗冠心病的机制主要有以下几个方面［12］,（1）抗血小板聚集：前期研究显示,血府逐瘀汤可干预血清PAF （血小板活化因子）含有量升高,以抑制血小板聚集,改善微循环及血管内皮功能,助缓动脉粥样硬化形成。（2）改善循环抗心肌缺血：研究报道,血府逐瘀汤通过下调CRP （反应蛋白）、BNP （脑钠肽）水平可缓解炎症的刺激,使血管舒张、血流量提升,减轻心肌容量负荷,避免心肌细胞受损。（3）调血脂：血府逐瘀汤通过降低后主动脉脂质斑块MPO （髓过氧化物酶）指标,使血脂四项含有量减少,从而使血管壁结构改变,延缓动脉粥样硬化（AS）进程。据《医林改错》 书中描述血府逐瘀汤由桃红四物汤、四逆散加桔梗、牛膝组成,其中桃红四物汤有活血化瘀而养血的功效；四逆散有疏肝理气,气行则血行得作用；另配伍桔梗引药上行于胸中,牛膝引血下行利血脉。诸药调和,共奏祛瘀、活血、行气、通络、止痛。另外对27个与中药（复方、单味药、中成药）相关的高频关键词进行聚类分析,如图3所示,27个高频关键词被从上到下依次分为10级树状图血府逐瘀汤处于树状图的最高级层,进一步说明血府逐瘀汤在治疗冠心病药物中的重要地位。

本研究发现经过系统药理学方法筛选,血府逐瘀汤中槲皮素在一定浓度范围内可明显抑制血管紧张素诱导的心肌成纤维细胞增值和胶原蛋白合成增加,同时可升高SOD含有量、降低MDA （丙二醛）活力,从而延缓心肌纤维化的发展［13］。异鼠李素具有抗炎、抗氧化、抗脂肪形成、抗增殖和抗肿瘤活性的作用,Gao等［14］新生大鼠心肌细胞中进行的体外研究证实,异鼠李素可以减弱血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大,而血管紧张素Ⅱ与PI3K-AKT信号通路有关,异鼠李素具有通过阻断PI3K信号传导途径靶向心脏肥大的保护潜力。Zhou等［15］通过对山柰酚处理对大鼠心肌缺血模型中发现,山柰酚预处理显着提高了LVDP（左室发展压）的恢复率和土dp/dt max,并提高了SOD和phospho-GSK-3β 水平以及GSH/GSSG （谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽）比值；减少了心肌梗塞面积和TUNEL （原位末端标记法）阳性细胞率,并降低了裂解的caspase-3 （半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3）、细胞质细胞色素C、CK （肌酸激酶）、LDH （乳酸脱氢酶）、MDA和TNF-α 的水平,通过抗氧化活性和抑制GSK-3β 活性提供心脏保护作用。Liao等［16］在小檗碱干预大鼠心肌梗死后心力衰竭模型中发现小檗碱能通过上调Bcl-2 （B细胞淋巴瘤）和下调caspase-3表达,从而抑制心脏重塑和保护心脏功能。除此之外,血府逐瘀汤中还有芍药苷、豆甾醇等通过调节炎症因子、细胞因子和氧化损伤来干预血管内皮细胞损伤,从而起到血管内皮保护作用的化合物。

在对血府逐瘀汤治疗冠心病的作用靶点其生物学过程分析中,提示血府逐瘀汤在治疗冠心病的过程中与一氧化氮合成、激活MAPK活动、血管生成等活动密切相关。TNF-α、IL-1B、MAPK1等均富集在以上通路中。TNF-α 参与免疫反应的调节,对冠状动脉上皮平滑肌细胞增殖具有诱导的作用,并且会诱导IL-β 等炎性因子的产生,从而促进动脉粥样硬化的发生。白细胞介素-1β 作为血清炎性指标的一类,对血管功能具有调节的作用,在冠心病中表达水平较高。p38MAPK参与了NF-κB的激活,可诱导缺氧心肌细胞凋亡,抑制p38MAPK可改善心肌损伤动物心功能不全、减少心肌细胞凋亡的发生［17］。过程在KEGG富集分析中得到的HIF-1 （缺氧诱导因子）信号通路,在现代药理学研究中表明［18］HIF-1α 在参与对低氧反应基因的调控,可以促进VEGF、促红细胞生成素（EPO）、HO-1等因子的表达。在冠心病发生、发展过程中HIF-1/HO-1被激活,通过抗氧化作用保护血管内皮细胞及心肌细胞并通过调节细胞生长减少内皮细胞凋亡,保护内皮系统的稳定性,同时促进血管平滑肌凋亡,减轻血管损伤后的不良重构。PI3K/AKT信号通路作为治疗心血管疾病的明星通路,PI3K/AKT信号通路的活化可以介导多种生物学效应,它通过调节心肌细胞凋亡、血管再生进而影响其在心血管系统的表达［19］。FoxO转录因子［20］是一类在许多生理功能中重要的高度保守蛋白。然而,即使FoxO是胰岛素的下游靶标,FoxO因子也控制上游信号元件控制胰岛素敏感性和葡萄糖代谢。FoxO活性的变化通过抑制蛋白磷酸酶对心肌细胞中的胰岛素信号传导具有剂量响应性抑制作用。此外KEGG信号通路分析结果提示除以上被证实的通路以外Focal adhesion信号通路,可以调节肌动蛋白,肌动蛋白的调节与第二生心区祖细胞构成非经典顶端-基底极性上皮有一定相关性。

本研究应用系统药理学方法对血府逐瘀汤药治疗冠心病的化学成分、作用靶点和作用机制进行初步探索性研究,以期为进一步的实验验证奠定基础。由于中药复方成分复杂、靶点众多等多种原因,中药方剂中可能存在的小分子多肽、或是中药复方通过肠道菌群调节等方式间接对疾病进行调控。且由于方法学限制未从中药所含化学成分的含有量进行分析,尚需从LC-MS/MS分析其真实入血成分。并且由于数据库信息不全面、目前认识的不全面性、化合物筛选的主观性,且只关注于药物的组成成分,忽略了其成分的含有量、化合物之间的相互作用以及药物体内代谢过程等的影响,故研究预测的结果具有一定的片面性和局限性,需要进一步加入实验验证。