不同生境下多花黄精化学成分比较

倪天宇，罗晓朦，张春椿，俞 冰，张水利，范慧艳

（浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053）

多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua为百合科黄精属植物,是一种重要的野生中药资源,与滇黄精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricumRed.一同收录于2015年版《中国药典》 一部［1］,为我国传统大宗药食同源的中药材。多花黄精主产于湖南、贵州、安徽、浙江、福建等省,生林下、灌丛或山坡阴处［2］,其味甘,平,归脾、肺、肾经,具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效［1］。现代药理研究表明,黄精具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、免疫调节、改善记忆障碍、保护肾功能等多种药理作用［3-7］。近年来,由于市场对黄精需求量的增加,引发药农掠夺性地采挖,导致野生多花黄精资源量骤减,已经不能满足市场需求。目前,许多学者对多花黄精的林下栽培技术模式进行研究,主要为毛竹林、杉木林及不同郁闭度坡向坡位对多花黄精生长量的影响［8-11］,但尚未见不同生境下多花黄精主要化学成分比较的报道。因此,本实验探讨了不同野生与人工种植生境下多花黄精折干率、浸出物、黄精多糖、总黄酮、总皂苷、总酚的变化规律,探索种植生境与药材产量、品质间的关系,以期为多花黄精规范种植提供理论依据。

1 材料

中药粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）；MS105DU电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；DHG-2150B电热鼓风干燥箱（郑州生元仪器有限公司）；G-060S超声波清洗机（深圳市歌能清洗设备有限公司）；RE52-AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；HH420电热恒温水浴槽（上虞道墟茂祥仪器设备厂）；752N紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。

无水葡萄糖对照品（批号20141211,上海强顺化学试剂有限公司）；芦丁 （批号100080-200707）、人参皂苷Rb1（批号110704-200420）、没食子酸对照品（批号110831-201204）,均购于中国食品药品检定研究院；福林酚（上海源叶生物科技有限公司）；蒽酮（上海展云化工有限公司）；硫酸 （西陇科学股份有限公司）；高氯酸（国药集团化学试剂有限公司）；亚硝酸钠、硝酸铝（上海振欣试剂厂）；氢氧化钠、无水乙醇、乙酸、香草醛（天津市科密欧化学试剂有限公司）等均为分析纯。

35批样品于2017年10至11月从浙江金华、丽水采集,经浙江中医药大学药学院俞冰副教授鉴定为百合科植物多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua的根茎,生长年限均为3年,样品信息见表1。其中针阔混交林、毛竹林、常绿阔叶林3种生境下的样品均为野外采收（无人工干预的野生环境）,大田及锥栗林为人工种植。

2 方法

2.1 折干率、浸出物及黄精多糖含有量测定 样品采收后除去须根、洗净,晾干表面水分后切成薄片,准确称定其鲜重,置于烘箱中105 ℃杀青30 min,60 ℃烘干至恒定质量,取出,降至室温后称定质量,计算折干率。

黄精多糖和浸出物含有量的测定参照2015年版《中国药典》 一部［1］和四部［12］中的方法,各组重复测定3次。以无水葡萄糖对照品质量浓度为横坐标（X）,吸光度为纵坐标（Y）,进行回归,得回归方程为Y=39.252X+0.026 7 （r=0.999 5）,在0.003 4～0.020 4 mg/mL范围内线性关系良好。精密度试验、稳定性试验、重复性试验RSD分别为1.09%、1.74%、1.92%；平均加样回收率99.81%,RSD 0.98% （n=9）。

2.2 总黄酮含有量测定

2.2.1 方法学考察 精密称取芦丁对照品40 mg,用50%乙醇超声溶解,转移至100 mL量瓶中并定容,充分摇匀,备用。分别吸取芦丁对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置于10 mL量瓶中,然后加入0.3 mL 5%NaNO2,摇匀,静置6 min,再加入0.3 mL 10%Al （NO3）3,摇匀,静置6 min,最后加入2 mL 4%NaOH,以50%乙醇定容,静置15 min,以空白试剂作对照,在510 nm处测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标（X）,吸光度为纵坐标（Y）,得回归方程为Y=9.530 2X-0.013 9 （r=0.999 8）,在0.004 1～0.041 0 mg/mL范围内线性关系良好。精密度试验、稳定性试验、重复性试验RSD分别为1.10%、1.96%、1.56%；加样回收率 99.40%,RSD 1.45%（n=9）。

2.2.2 样品总黄酮含有量测定 精密称取多花黄精粉末1.5 g,平行3份,分别置于20 mL具塞试管中,加入15 mL 50% 的乙醇溶液（加入1% 盐酸）,超声（360 W,40 kHz）提取1 h,滤过,滤液用50%乙醇定容至25 mL。精密吸取0.3 mL,按“2.2.1” 项下方法测定和计算多花黄精总黄酮的含有量［13］。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.3 总皂苷含有量测定

2.3.1 方法学考察 精密称取人参皂苷Rb1对照品10 mg,置10 mL量瓶中,加无水甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用。分别量取人参皂苷Rb1对照品溶液0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL,置于具塞刻度试管中,挥尽溶液,加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液（现配）及0.8 mL高氯酸,摇匀,置于60 ℃水浴加热15 min后,冰浴2 min,再加入5 mL冰醋酸,摇匀,静置5 min。以相应的试剂为空白,照紫外-可分光光度法,在568 nm波长处测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标（X）,吸光度为纵坐标（Y）,进行回归,得回归方程为Y=16.507X+0.024 6 （r=0.999 0）,在0.009 6～0.067 2 mg/mL范围内线性关系良好。精密度试验、稳定性试验、重复性试验RSD分别为1.34%、1.97%、1.99%；加样回收率98.01%,RSD 1.70% （n=9）。

2.3.2 样品总皂苷含有量测定 精密称取多花黄精粉末1.0 g,平行3份,分别加入80% 乙醇15 mL,60 ℃超声提取50 min,重复提取2次,合并滤液至50 mL量瓶中,加入80% 乙醇定容。精密吸取0.1 mL,按“2.3.1” 项下方法测定和计算多花黄精总皂苷含有量［14］。

2.4 总酚含有量测定

2.4.1 方法学考察 精密称取没食子酸对照品13 mg,置于50 mL量瓶中,加入20 mL 70%乙醇,超声使其充分溶解,用70%乙醇定容,摇匀备用。分别取没食子酸对照品溶液20、40、60、80、100、120 μL置于5 mL量瓶中,依次加入3.2 mL蒸馏水,福林酚显色剂200 μL,充分振荡后静置6～8 min,加入15% Na2CO3溶液500 μL,摇匀,在室温下避光放置反应2 h,在765 nm波长处测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标（X）,吸光度为纵坐标（Y）,进行回归,得回归方程为Y=77.945X+0.022 7 （r=0.999 2）,在0.001 1～0.006 4 mg/mL范围内线性关系良好。精密度试验、稳定性试验、重复性试验RSD分别为0.99%、1.99%、1.87%；加样回收率 100.51%,RSD 1.77% （n=9）。

2.4.2 样品总酚含有量测定 精确称取多花黄精粉末1.0 g,平行3份,分别置于试管中,加入10 mL 70% 乙醇,超声 （360 W,40 kHz）提取30 min,滤过,取滤液,反复提取3次。合并滤液旋干,并用70% 乙醇定容至50 mL。精密吸取100 μL,按“2.4.1” 项下方法测定和计算多花黄精总酚含有量［13］。

2.5 统计分析 采用Excel 2010和SPSS 25.0统计软件对所测定的数据进行整理分析；采用单因素方差分析比较不同生境下多花黄精的折干率、浸出物、多糖、黄酮、皂苷、总酚含有量的差异；利用相关性分析分析各检测指标之间的相关性；采用主成分分析评价各生境下多花黄精品质的优劣。

3 结果

3.1 折干率比较 折干率是指药材干燥前后质量之比,是衡量药材产率的重要指标,折干率越大,药材得率越高。由表2可知,针阔混交林生境下多花黄精折干率与毛竹林、常绿阔叶林、锥栗林生境均存在统计学差异（P＜0.05）,毛竹林与大田、常绿阔叶林生境差异有统计学意义（P＜0.05）,人工种植的大田与锥栗林模式样品折干率亦存在统计学差异（P＜0.05）。折干率均值由大到小依次为毛竹林、锥栗林、常绿阔叶林、大田、针阔混交林。

3.2 浸出物比较 不同生境下多花黄精醇溶性浸出物测定结果见表2,锥栗林生境下醇溶性浸出物最高,针阔混交林生境下醇溶性浸出物最低,分别为72.93%、63.40%,各生境下浸出物含有量均高于2015年版《中国药典》 规定的不得少于45%的标准［1］。方差分析结果表明,人工种植下的锥栗林生境中样品的浸出物含有量与针阔混交林、毛竹林、大田生境均存在统计学差异（P＜0.05）。浸出物均值由大到小依次为锥栗林、常绿阔叶林、毛竹林、大田、针阔混交林。

3.3 黄精多糖比较 黄精多糖是黄精的一种重要活性成分,其含有量被2015年版《中国药典》 列为多花黄精的质量考察指标,根据药典要求,黄精多糖含有量≥7%为符合标准［1］。由表2可知,不同生境下黄精多糖含有量在5.35%～7.18%范围之间,仅锥栗林生境下的样品达到药典标准。经单因素方差分析,针阔混交林生境下黄精多糖含有量与毛竹林、锥栗林均存在统计学差异（P＜0.05）。各生境黄精多糖均值由大到小依次为锥栗林、毛竹林、常绿阔叶林、大田、针阔混交林。

3.4 总黄酮比较 多花黄精含有天然高异黄酮类化合物［15］,由表2可知,不同生境下多花黄精总黄酮含有量在9.37～12.53 mg/g之间。其中,大田生境下最高,针阔混交林生境下最低,大田比针阔混交林、毛竹林、常绿阔叶林、锥栗林分别高出3.16、2.85、2.09、2.11 mg/g。方差分析可知,不同生境类型下多花黄精总黄酮含有量差异无统计学意义（P＞0.05）。各生境下样品总黄酮均值由大到小依次为大田、常绿阔叶林、锥栗林、毛竹林、针阔混交林。

3.5 总皂苷比较 各生境下多花黄精总皂苷含有量测定结果见表2,其总皂苷含有量在25.78～84.98 mg/g范围之间。方差分析结果表明,锥栗林生境下总皂苷含有量高于其余4种生境（P＜0.05）,为84.98 mg/g；毛竹林、常绿阔叶林生境总皂苷含有量均高于大田模式（P＜0.05）,分别为51.96、52.84 mg/g；大田和针阔混交林生境无统计学差异（P＞0.05）,分别为25.78、38.28 mg/g。各生境下样品总皂苷均值由大到小依次为锥栗林、常绿阔叶林、毛竹林、针阔混交林、大田。

3.6 总酚比较 由表2可知,不同生境下多花黄精总酚含有量在0.56～1.67 mg/g之间。其中,毛竹林生境下最高,常绿阔叶林生境下最低,毛竹林比针阔混交林、常绿阔叶林、大田、锥栗林分别高出0.55、1.11、0.70、0.47 mg/g。经单因素方差分析,不同生境类型下多花黄精总酚含有量无统计学差异（P＞0.05）。各生境下样品总酚均值由大到小依次为毛竹林、锥栗林、针阔混交林、大田、常绿阔叶林。

表2 不同生境下多花黄精化学成分含有量比较Tab.2 Content comparison of chemical constituents of P.cyrtonemain different growing areas

3.7 相关性分析 相关性分析见表3。各检测指标之间相关性显著,不互相独立。多花黄精折干率与总皂苷呈正相关（P＜0.01）,浸出物与总皂苷呈正相关（P＜0.05）。相关性分析表明,折干率与主要化学成分含有量均呈正相关,这与陈怡等［16］报道一致,折干率可以从侧面反映各部分水分和干物质储存状况,折干率较大,表明生长代谢活跃。

表3 多花黄精各评价指标相关性分析Tab.3 Correlation analysis of chemical constituents in P.cyrtonema

3.8 主成分分析 为比较不同生境下多花黄精品质的优劣,采用SPSS 25.0软件对所测指标进行主成分分析。由表4可知,当主成分个数达到3时,主成分累计贡献率为72.426%,其中第1主成分贡献率最大,达35.498%。用3个主成分对不同生境下的多花黄精进行综合评价,其综合评价函数为F=0.490F1+0.276F2+0.234F3,可知,F1对综合评分的影响最大,其中多花黄精的折干率、浸出物、黄精多糖和总皂苷在第1主成分上有较高载荷,见表5,表明上述4个指标对于多花黄精的品质影响较大。通过上述综合评价函数计算各生境下样品的综合得分,结果见表6。各生境下多花黄精综合得分由大到小依次为锥栗林、毛竹林、常绿阔叶林、大田、针阔混交林。

4 讨论

生境类型是影响多花黄精生长和次生代谢物累积的因子之一［17］。本研究发现,不同生境下多花黄精的折干率、浸出物含有量、黄精多糖以及总皂苷含有量的差异较大。2种人工种植模式中,锥栗林生境下多花黄精的品质优于大田生境。由于多花黄精生长期喜阴湿润凉,不耐高温［18］,适当遮荫可促进其生长,但过度遮荫反而会抑制其根茎生长［19］。锥栗林生境较大田而言,增加了锥栗的遮荫,为林下种植的多花黄精构造出相对阴湿的环境,更适宜其生长,因此,锥栗林生境下产出的多花黄精品质更优。黄精多糖及浸出物含有量被2015年版《中国药典》 列为黄精药材的质量考察指标,根据药典要求,黄精多糖含有量≥7%,浸出物≥45%为符合标准［1］,因此仅锥栗林生境下的多花黄精达到药典标准,其余样品均低于药典标准。

表4 主成分分析特征值Tab.4 Eigenvalues of principal component analysis

表5 各成分主成分特征向量Tab.5 Eigenvectors of the principal components of various constituents

表6 不同生境下多花黄精综合得分与排名Tab.6 Comprehensive score and ranking of P.cyrtonemafrom different growing areas

3种野生生境中,毛竹林生境下多花黄精的品质最优,常绿阔叶林生境次之,针阔混交林排名最末。3种野生生境的物种组成、林分结构、多样性等均存在差异,这些因素均可对多花黄精的品质产生影响。常绿阔叶林和针阔混交林群落物种组成丰富、多样性指数高,林分生物量、掉落物均显著高于毛竹林［20］。因此在没有人工干预的情况下,可能形成了过度遮荫的效果,影响了多花黄精次生代谢产物的积累,同时丰富的群落物种也极易与多花黄精形成群落内的种间竞争。而毛竹林是上述生境中,结构最简单、林中物种组成最少、多样性最差的群落类型［20］,种间竞争压力小,且其遮荫度可能正好适合多花黄精的生长,结果导致毛竹林生境下多花黄精品质要优于常绿阔叶林和针阔混交林。

人工种植的锥栗林下多花黄精的品质优于野生的毛竹林,锥栗与多花黄精的林下复合种植,为多花黄精构造出相对阴湿的环境,且通过人工措施干预,调控了林分的郁闭度和群落的物种量,适度遮荫的同时,减少了野外环境中存在的群落内种间竞争,保证了锥栗林生境下多花黄精药材的品质。锥栗林生境下多花黄精的浸出物、黄精多糖以及总皂苷含有量均为最高,折干率和总酚仅次于毛竹林生境,总黄酮含有量位列第三,通过主成分分析可知,5种不同类型生境中,以锥栗林生境下种植的多花黄精品质最佳。多花黄精在锥栗林下的种植模式属于典型的林药间作模式,它将适宜在林下生长、具有一定耐荫性的药用植物引种到林下进行栽培,不仅种植的多花黄精品质优异,还可充分利用土地资源,获得更高的社会经济利益和生态效益［21］,锥栗与多花黄精的林下复合种植模式值得推广。