永生化人肝星状细胞株WM07 的建立

郭津生 王 满

（复旦大学附属中山医院消化科 上海 200032）

肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝脏的一种非实质细胞，在肝纤维化发生中起到关键作用。原代分离的HSC 在体外的培养和传代时间有限，传代一定次数后就会进入衰老期而不能再继续增殖。而反复分离原代细胞不仅费时、费力，且各批次细胞间存在差异，不能保持细胞生理指标的稳定性。体外能无限培养的永生化HSC 的建立可为科学研究提供稳定、充足的细胞材料。建立和改良人HSC 的分离培养方法及获得永生化人HSC 株对于肝纤维化发生机制、诊断及治疗研究具有重要意义。

已有通过脂质体介导猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）大肿瘤抗原（large tumor antigen，TAg）基因的真核表达质粒转染获得永生化人HSC（LX1 及LX2）的报道［1］。既往研究中，我们采用改良酶液灌注消化及密度梯度离心两步法从1 例中国儿童肝肿瘤手术患者的肝脏标本中分离HSC［2］，液氮冻存原代细胞。本研究通过构建慢病毒SV40 TAg 表达质粒，介导SV40 TAg 转染该原代HSC，获得永生化人HSC 株（命名为WM07），可稳定传代并用于肝纤维化研究。

材料和方法

构建SV-40 TAg 慢病毒表达载体

PCR 获取全长SV40 TAg 序列 以含SV40 TAg cDNA 序列的SV40 tsA58 质粒［3-5］为模板，根据NCBI 的SV40 TAg 完整基因参考序列（NC_001669.1）设计特定的质粒构建引物。SV40 TAg-CF：5’-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3’；SV40 TAg-CR：5’-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGA-3’。

高保真PCR 获取SV40 TAg 全长cDNA PCR反应体系（50 μL）：引物混合液1.5 μL，10×Pfu DNA 聚合酶反应混合物（含dNTP）5 μL，Pfu DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 质粒1 μL，用灭菌去离子水补齐到50 μL。PCR 反应条件：95 ℃2 min；95 ℃15 s，58 ℃30 s，68 ℃4 min，36 个循环；68 ℃5 min；恢复至4 ℃。

PCR 产物纯化 PCR 产物进行1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，切割回收SV40 TAg 全长cDNA PCR 条带，pureLinkRQuickGel（美国Invitrogen 公司）提取纯化PCR 产物，测定并调整为10 ng/μL浓度。

PCR 产物TOPO 克隆进入pENTRTMTOPO®载体 纯化的SV40 TAg PCR 产物4 μL，盐溶液1 μL，pENTRTMTOPO®载体（美国Invitrogen 公司）1 μL，总体积6 μL，室温轻柔混匀，室温放置30 min，置于冰上。

转化和Entrez 克隆筛选 TOPO®克隆反应产物2 μL 转化感受态大肠埃希菌（E.coli），接种于卡那霉素LB 琼脂板，37 ℃培养过夜，挑选5 个生长菌落扩增和提取质粒，以M13 正向和逆向引物进行PCR 测序（韩国Macrogen 公司），鉴定克隆的SV40 TAg cDNA 序列，获得pENTR-SV40 TAg Entrez质粒。

LR重组反应 1.5 mL离心管中加入7 μL上述克隆表达质粒pENTR-SV40 TAg（150 ng）、1 μL 目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST（美国Invitrogen 公司）、8 μL TE 缓冲液、2 μL LR Clonase™Ⅱenzyme mix，混匀，25 ℃孵育1 h，加入1 μL 蛋白酶K 溶液终止反应，混匀后37 ℃孵育10 min。

将SV40 TAg cDNA 克隆到目标慢病毒载体转化1 μL LR 反应液与50 μL Stbl3TM感受态细胞，冰上孵育30 min，42 ℃热休克30 s，加入250 μL SOC 培养液，37 ℃振摇培养1 h，分别将20 μL 和100 μL 转化液铺于氨苄青霉素LB（LBA）琼脂板。37 ℃培养过夜，挑选5 个生长菌落扩增和提取质粒。以CMV 正向和逆向引物进行PCR 测序（韩国Macrogen 公司），鉴定克隆的SV40 TAg cDNA 序列，构建SV40 TAg 慢病毒表达载体pLenti4/V5-GW/SV40 TAg。

慢病毒包装采用脂质体LipofectamineTM3000介导pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒质粒（假病毒）和包装质粒pCMV-VSV-G 及psPAX2（2∶1.5∶1）转染工程细胞293FT，进行假病毒包装，24、48、72 h 分别收集含包装病毒的培养上清液，离心，冻存备用。

HSC 分离和原代培养复旦大学附属中山医院外科手术切除人肝脏肿瘤标本，无菌操作切取病灶周围相对正常的一小块肝组织，按5 mL/g 用EGTA 液（含肝素20 U/mL）沿血管残端反复灌注冲洗残余血液，至肝组织呈灰黄色。采用改良酶液灌注消化及Nycodenz 密度梯度离心两步法获得原代HSC［2］。采用常规台盼蓝拒染法鉴定细胞活力。采用自发蓝绿色荧光、油红O 脂滴染色、α-平滑肌肌动蛋白（α-smα-SMA）、免疫荧光染色等方法鉴定细胞纯度［2］，每3 天换液1 次，原代冻存。

永生化HSC 株WM07 的建立

SV40 TAg 转染原代培养细胞并筛选转染细胞 以含SV40 TAg 的慢病毒培养上清液加入细胞培养液中转染原代（复苏第2 代）培养细胞，48 h 后换用含50 μg/mL 博来霉素（zeocin）的10%胎牛血清的DMEM 培养液筛选转染和稳定表达SV40 TAg的原代细胞，每3天换液1 次，2～4 周后可筛选出存活细胞克隆，扩增成株。细胞株至少能稳定传十代。

SV40 TAg 表达的检测 一抗采用抗SV40 TAg 抗体（1∶200，美国Santa Cruz 公司，sc-148），用Alexa Fluor 594（红色）标记的二抗进行免疫荧光染色，检测SV40 TAg，可作为SV40 TAg 转染获得永生化细胞的标志。

α-SMA 的检测 一抗采用抗α-SMA（1∶500，英国Abcam 公司，ab5694），用Alexa Fluor 488（绿色）标记的二抗进行免疫荧光染色检测α-SMA，作为活化HSC 的标志。

结果

SV40 TAg 全长cDNA 的鉴定高保真PCR 获取的SV40 TAg 全长cDNA 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR 条带大小符合全长SV40 TAg cDNA 片段大小（2 477 bp，图1）。

图1 高保真PCR 获取SV40 TAg 全长cDNA 的琼脂糖凝胶电泳图Fig 1 Agarose gel electrophoresis map showing a single band of high-fidelity PCR product of SV40 TAg full-length cDNA fragment

pENTR-SV40 TAg Entrez 质粒的鉴定通过M13 正向引物对pENTR-SV40 TAg Entrez 质粒进行PCR 测序，结果验证所构建的pENTR-SV40 TAg Entrez 质粒含CACC 克隆位点（122～125）、ATG 转录起始位点（126～128）及SV40 TAg cDNA序列（图2）。

慢病毒表达质粒pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 的鉴定通过CMV 正向引物对pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒表达质粒进行PCR 测序，结果验证所构建的质粒含ATG 转录起始位点（151～153）及SV40 TAg cDNA 序列（图3）。

永生化HSC 株WM07 表达>SV40 Tag对经慢病毒介导SV40 TAg 转染、博来霉素筛选获得的永生化肝星状细胞株WM07 进行SV40 TAg 的免疫荧光染色，结果显示WM07 表达SV40 TAg，并在细胞核表达和定位（图4）。

永生化HSC 株WM07 表达活化HSC 标志物免疫荧光染色鉴定显示，WM07 细胞质内均表达活化HSC 的特异性标志α-SMA（图5）。

讨论

图2 M13 正向引物对pENTR-SV40 TAg Entrez 质粒进行PCR 测序的结果Fig 2 The PCR sequencing result of pENTR-SV40 TAg Entrez plasmid by M13 forward primer

图3 CMV 正向引物对pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒表达质粒进行PCR 测序结果Fig 3 PCR sequencing result of the expression plasmid of pLenti4/v5-GW/SV40 TAg lentivirus with CMV forward primer

图4 免疫荧光染色永生化HSC 株WM07 的SV40 TAg 表达（×100）Fig 4 Immunofluorescence staining of SV40 TAg expression in theimmortalized HSC line WM07（×100）

图5 免疫荧光染色永生化人HSC 株WM07 的α-SMA 的表达（×20）Fig 5 Immunofluorescence staining of α-SMA expression in immortalized human HSC line WM07（×20）

一些抑癌基因p53 和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人体细胞获得永生化的必要条件。哺乳动物细胞使用几种方法诱导细胞永生化，包括使用SV40TAg基因、人类端粒酶逆转录酶基因、P53 和pRB 的小发卡或短发卡RNA（shRNA）等。SV40 TAg 是由SV40 病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白，在病毒复制过程中发挥重要作用。SV40 TAg 具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA 合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，并且能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员（如pRB）、肿瘤抑制因子P53 等，并可诱导感染细胞的端粒酶活性，诱导多种细胞的永生化。SV40TAg基因与宿主细胞DNA稳定整合重组后，不但能在细胞内表达SV40 TAg，加快转化细胞的生长速率，同时也能保留原始细胞的许多分化表型，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，而在转化细胞系中非原始基因的表达很少见。

目前已有一些方法用于介导SV40 TAg 转染，如通过脂质体介导构建有SV40TAg基因的真核表达质粒载体，转染目标原代细胞，并筛选获得永生化细胞系的方法，但其转染效率较低，筛选困难，一些较难转染的细胞难以获得稳定表达和建立细胞系。慢病毒是逆转录病毒的一种，能够将靶基因导入一些较难转染的细胞内，可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，并且将靶基因随机整合到宿主HSC 基因组中，从而大大增加了感染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。慢病毒已广泛用于基因功能研究、RNA干扰、小分子RNA 研究及活体动物实验中，成为基因治疗的有力工具之一。既往研究中，我们采用慢病毒载体构建和转染方法成功进行了Toll 样受体4及DDX5 单核苷酸基因多态性的表达和功能探讨［7-8］。本研究构建一种能够高效、快速转染SV40 TAg 慢病毒的表达载体，该载体通过工程细胞包装可获得表达SV40 TAg 的慢病毒颗粒（假病毒）用于转染原代人HSC，进而通过博来霉素抗性特点筛选获得永生化细胞株。提供一种构建永生化细胞株的方法，并获得一株永生化HSC 株WM07，可稳定传代，并可用于肝纤维化研究，具有重要的应用价值。

致谢美国纽约西奈山肝病中心Scott L.Friedman 教授给予指导和帮助。