骨膜蛋白在玻璃体视网膜疾病中作用机制的研究进展

增生型糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)等玻璃体视网膜疾病是现阶段导致相应人群视力下降和丧失的主要原因，上述眼疾最重要的病理特征是晚期脉络膜或视网膜纤维血管膜(fibrovascular membrances, FVMs)的形成。增生的FVMs所引起的玻璃体出血或牵拉性视网膜脱离是患者视力丧失及术后预后不良的最主要原因。目前，DR治疗主要以视网膜激光光凝、抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、激素和手术治疗为主[1],在临床上针对因玻璃体积血或视网膜脱离达到行玻璃体切割手术指征的PDR患者通常术前联合抗VEGF治疗。但是常常因为FVMs的存在，术中术后并发症的发生率增加，且患者术后视力往往恢复不佳。因此，寻找玻璃体视网膜疾病的新的生物学标记物和治疗靶点对疾病的早期发现、早期诊断及早期治疗至关重要。骨膜蛋白(Periostin，PN)是一种独特的细胞外基质蛋白，参与人体各组织器官的相应免疫炎症反应，如心肌梗死后重塑[2]、骨髓纤维化[3]、牙周组织再生修复[4]、皮肤伤口愈合[5]、肿瘤细胞转移[6]、肾脏损伤[7]、以及可诱导慢性过敏性疾病[8]等。骨膜蛋白在眼部的主要作用包括促进细胞增殖、分化、迁移和粘附，诱导纤维形成以及促进新生血管等[8]。Yoshida等[9]对PDR患者增生的纤维血管膜cDNA文库的7000个随机序列测序发现，骨膜蛋白在FVMs中的表达比在特发性视网膜前膜中的表达更高。Takada等[10]通过蛋白质组学技术分析了骨膜蛋白是PDR的一种新的生物学标记物。越来越多的国内外研究证明，骨膜蛋白是各玻璃体视网膜疾病中的关键因子，骨膜蛋白有望成为玻璃体视网膜疾病的新的生物学标志物，以此提供新的治疗策略。

一、骨膜蛋白的发现、染色体定位、结构与功能

骨膜蛋白最早在1993年由Takeshita等[11]在小鼠成骨细胞系MC3T3-E1的cDNA文库中通过mRNA减法杂交和微分筛选技术发现和鉴定的。早期因其主要是成骨细胞及其前体分泌产生并可在骨形成中发挥着重要作用，故被称为成骨细胞特异性因子2(osteoblast-specific factor-2，OSF-2)。1999年研究发现OSF-2显著表达在人体骨膜和牙周组织中，其不仅参与骨和牙齿组织的正常生理性发育，且与骨折、牙周疾病病理状态下的修复也密切相关，便更名为骨膜蛋白。

骨膜蛋白由Postn基因编码，鼠和人类的骨膜蛋白有89.2%的氨基酸相同，小鼠的Postn基因位于3号染色体，人类的Postn基因位于13号染色体[12]。骨膜蛋白是一种保守的分泌型细胞外基质蛋白，相对分子质量为90kD，主要分子结构由四个部分构成：特征性信号肽序列、EMI结构域(富集半胱氨酸的区域)、FAS-1结构域(4个同源串联重复结构区域)和C末端区域[13]。EMI结构域结合I型胶原及纤维连接蛋白。由于存在FAS-1结构域，骨膜蛋白属于成束蛋白家族[14]，FAS-1结构域与tenascin-C和BMP-1结合，且第2、第4个结构域存在整合素结合位点。C末端区域在转录的过程中易发生缺失、插入，从而可产生功能不同的骨膜蛋白剪接变构体[15]。Nakama等[16]构建氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)模型小鼠并对其骨膜蛋白的C末端区域的相应基因做基因敲除，接着向小鼠玻璃体腔注射骨膜蛋白剪接变构体对应的抗体，最后分析实验组小鼠和空白对照组小鼠视网膜新生血管网密度变化和视网膜无灌注区面积改变，实验揭示缺少不同外显子对应的骨膜蛋白剪接变构体均具有促进病理性新生血管形成的作用，其中C末端区域缺少外显子17的骨膜蛋白剪接变构体作用最强，而C末端区域缺少外显子21的骨膜蛋白剪接变构体则可抑制生理性血管重建。

二、玻璃体视网膜疾病与巨噬细胞的极化

巨噬细胞在机体固有免疫和特异性免疫中发挥着不可或缺的作用，具有趋化性运动、吞噬、分泌相应细胞因子和抗原呈递等功能。巨噬细胞在不同的微环境影响下可极化为不同表型从而改变其功能特征，主要有M1型即经典活化的巨噬细胞(CD68+、CD86+、MHCⅡ+为表型特征)和M2型即替代活化的巨噬细胞(CD68+、CD163+、FRβ+为表型特征)[17]。

巨噬细胞极化及其产生的相应细胞因子和炎症因子介导的免疫反应是多种眼部疾病的重要发病机制。巨噬细胞的极化与AMD的脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的形成有着一定的联系。随着AMD病程的进展，巨噬细胞由M1型向M2型极化，活化后的M2型巨噬细胞通过激活信号通路上调VEGF的表达，以促进CNV的形成[18]。巨噬细胞极化同样发生在PDRⅤ期FVMs增生过程中。2015年Zhou等[19]在OIR小鼠模型中发现表达CD163的M2型巨噬细胞聚集在新生血管束附近；Kobayashi等[20]通过ELISA检测发现PDR患者的玻璃体和FVMs中CD163的表达增加，而CD163是M2型巨噬细胞标志物[21]，由此可见糖尿病性视网膜病变眼内微环境中M2型巨噬细胞占主要优势。

三、骨膜蛋白在玻璃体视网膜疾病中的作用机制

1.骨膜蛋白与增生型糖尿病性视网膜病变：当前，糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)已成为全球糖尿病患者严重威胁视力的微血管并发症，在我国，主要是50 岁以上人群最主要的致盲性眼病。国内外大量文献报道DR发生的明确病因不详，主要是氧化应激、多元醇代谢通路的异常、蛋白激酶C(PKC)的活化、蛋白质非酶糖基化产物的堆积、血管紧张素转化酶系统等的相互作用[22]。DR主要的病理过程为：微血管细胞损害使得微血管扩张或形成微血管瘤或发生渗漏，导致微血管闭塞，无灌注区形成，进一步导致视网膜缺血缺氧，PDRⅤ期眼底出现新生血管和形成FVMs。按DR发展阶段和严重程度，临床分为非增生型(nonproliferative diabetic retinopathy, NPDR)和增生型，PDR最核心、与NPDR相区别的是视网膜FVMs形成。Yoshida等[23]通过对84例PDR患者106只术眼及31例黄斑裂孔(macular hole, MH)患者31只术眼玻璃体液进行RT-PCR和ELISA检测发现，PDR患者玻璃体中骨膜蛋白的水平显著高于MH患者，且伴有增生FVMs的PDR患者玻璃体液中骨膜蛋白浓度高于无FVMs患者。由此可见，骨膜蛋白参与PDR患者FVMs的增生。

Kobayashi等[20]通过ELISA法检测PDR患者玻璃体CD163及骨膜蛋白浓度发现，CD163与骨膜蛋白呈显著相关性；免疫组化实验显示，CD163和骨膜蛋白在FVMs中共定位，揭示了表型为CD163的M2型巨噬细胞可产生骨膜蛋白。2015年Yoshida等[24]通过体外试验发现M-CSF处理的巨噬细胞IL-13也可显着诱导CD163表达上调，但在程度低于M-CSF处理的巨噬细胞。此外，单纯加入M-CSF因子，巨噬细胞并不增加骨膜蛋白mRNA的表达。然而，添加IL-13到M-CSF处理的巨噬细胞中却可显著提高骨膜蛋白mRNA的水平，约10倍。这些结果表明，骨膜蛋白、M2型巨噬细胞与PDR患者FVMs的形成有着密不可分的联系。具体机制为：PDR患者招募的单核细胞通过巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colonystimulating factor，M-CSF)、IL-13极化为活化M2型巨噬细胞表达骨膜蛋白，骨膜蛋白通过与整合素αvβ3作用介导黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)激活通路[25]，上调VEGF受体2的表达，从而促进FVMs中新生血管的形成；又可使丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)发生磷酸化，从而激活相应信号通路并产生多种细胞因子如转化生长因子、血小板衍生生长因子等，打破抑血管生长因子和促血管生长因子之间的平衡且纤维细胞进一步增殖，进一步诱导新生血管的形成和纤维化[26，27]。此外，骨膜蛋白能与肌成纤维细胞相互作用，以促进FVMs在视网膜的黏附与侵袭[28]，从而增加了PDR患者并发症如孔源性视网膜脱离的发生率以及玻璃体手术剥离FVMs的失败率。

2.骨膜蛋白与增生性玻璃体视网膜病变：PVR多见于孔源性视网膜脱离术后并发症。PVR视网膜表面和玻璃体后可形成纤维细胞性增殖膜(ERMs)，增殖膜的收缩、牵拉可再次引起视网膜脱离，同样是造成许多眼疾病恶化、视力丧失的重要原因。PVR的具体病因机制尚不明确，但在玻璃体和增殖膜中异常表达的细胞因子驱动着PVR整个病程的进展。其中，RPE细胞表达的骨膜蛋白在PVR增殖膜的形成中扮演着特殊角色。Ishikawa等[29]通过PCR检测到PVR-ERMs中骨膜蛋白mRNA表达，但在正常视网膜中几乎没有，揭示骨膜蛋白主要由RPE细胞表达。此外，研究发现PVR患者玻璃体中的骨膜蛋白和TGF-β2的浓度显著高于黄斑前膜患者，且骨膜蛋白浓度与TGF-β2浓度之间有很强的相关。TGF-β2可以促进PVR视网膜RPE细胞转化为肌成纤维细胞产生骨膜蛋白[30]。骨膜蛋白进一步以自分泌方式结合整合素激活FAK和AKT通路，以增强RPE细胞的增生、分化、迁移和黏附[28，30]，导致ERMs的形成。

3.骨膜蛋白与年龄相关性黄斑变性：AMD是60岁以上老年人群视力不可逆损害的首要原因，现已成为全球主要的老年性致盲眼病之一。AMD是一种遗传与非遗传因素共同作用的复杂性、难治性疾病。晚期AMD可出现脉络膜病理性新生血管(CNV)及纤维化[31]，这一过程涉及血管内皮细胞、RPE细胞、成纤维细胞、胶质细胞和巨噬细胞等细胞的增殖、分化、迁移和黏附，同时血管内皮生长因子、胎盘生长因子、结缔组织生长因子和转化生长因子β及其受体[32，33]等细胞因子也参与其中。玻璃体腔注射抗VEGF是现阶段临床上延缓AMD进展的最有效治疗手段。目前大量研究发现且证实抗VEGF治疗在一定程度上可抑制CNV，但尚不能抑制纤维化的进展[32]。此外，最近有关报道[34-36]表明,玻璃体内注射抗VEGF可导致视网膜损伤和促进脉络膜纤维化。因此视网膜下或脉络膜纤维化仍然是一种严重威胁视力的病理状态。Nakama等[37]利用激光损伤视网膜构建视网膜脉络膜层纤维化的小鼠模型，通过研究发现实验组视网膜色素上皮-脉络膜复合物上骨膜蛋白mRNA的表达及骨膜蛋白的含量比对照组高，并在第14天的时候达到高峰。此外，免疫组织化学分析显示，激光损伤后RPE65阳性的RPE细胞中出现骨膜蛋白阳性染色；在人类脉络膜FVMs中，发现角蛋白阳性的RPE细胞中的骨膜蛋白表达增强。以上实验结果均表明RPE细胞表达骨膜蛋白。骨膜蛋白在AMD的发生发展中同样有着重要的作用，视网膜CNV的形成及纤维化的发生主要的机制是由RPE分泌的骨膜蛋白与整合素αvβ3相互作用。

四、新型骨膜蛋白靶向制剂

2018年刘舒静等[38]研究发现降低骨膜蛋白可抑制糖尿病性视网膜病变的发展。虽然抗VEGF治疗在临床上应用广泛，其在一定程度上可抑制视网膜新生血管的发生发展，但现阶段不少实验证明，玻璃体内注射抗VEGF可导致视网膜损伤并可能促进视网膜纤维化[36]。因为本身VEGF在视网膜稳态中起着关键的平衡作用，另外VEGF与血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)结合并主要通过PLCγ/PKC/MAPK途径促进视网膜新生血管[39]，而骨膜蛋白主要与整合素的结合并通过FAK/AKT途径来促进新生血管[40]，且正常视网膜组织中骨膜蛋白含量极少。Yoshida等[23]也报道PDR患者玻璃体VEGF浓度与骨膜蛋白之间的相关性较弱。因此，针对视网膜和脉络膜新生血管及纤维化，抗VEGF及针对骨膜蛋白靶向治疗是相互独立的。

RNA干扰(RNAi)技术主要是利用双链RNA降解同源基因mRNA以实现转录后基因沉默，从而特异性抑制目的基因[41]。Nakama等[39]通过构建OIR小鼠模型和体外培养的人视网膜微血管内皮细胞(HRECs)研究了骨膜蛋白在视网膜新生血管中所起的作用且评价了针对视网膜新生血管的骨膜蛋白的单链RNAi(NK0144)的治疗效果。针对骨膜蛋白的单链RNAi试剂能显著抑制OIR小鼠视网膜新生血管以及由IL-13驱动的HRECs的迁移和管的形成。除此之外，激光损伤Postn基因缺失的小鼠发现其脉络膜新生血管及纤维化的平均面积均明显小于野生型小鼠。因此，玻璃体内注射单链靶向骨膜蛋白RNAi可能是一种安全、有效的阻断玻璃体视网膜病变视网膜新生血管及纤维化的新的治疗策略。

五、展望

过去十年中，随着医疗的日益发展，临床针对PDR、PVR及AMD等增生性玻璃体视网膜疾病的治疗方法主要涉及抗VEGF治疗、激光光凝、玻璃体切割术等，但多数患者术后视力恢复不佳，是否存在新的生物学标志和诊治靶点是大家关注的重点。骨膜蛋白在增生性玻璃体视网膜疾病异常表达且在疾病发生发展中发挥着重要作用，可以通过抑制其表达阻碍玻璃体视网膜疾病的进一步发展，骨膜蛋白有望成为玻璃体视网膜疾病新的生物学标志和诊治靶点。然而，现阶段新型骨膜蛋白靶向制剂仅在少数体外及动物实验中应用，证明其安全性及有效性仍需要更多的随机对照实验来验证。